זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית
6 באוקטובר 2022
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.
שיטה זו מציעה דרך להגביר את האות מאירועי קשירה לצורה הניתנת לזיהוי חזותי לשימוש דל במשאבים או שניתן לכמת באמצעות מכשור מבוסס ספיגה. זהו פרוטוקול מהיר יחסית, חד פעמי, כדי לקבוע את נוכחות המטרה של האפתמר במדגם של עניין. ניתן להשוות את התוצאות מול עקומת כיול סטנדרטית אם רוצים לכמת.
אנשים חייבים להיות מדויקים מאוד בעת העברת וערבוב הפתרונות, כמו ערבוב מספיק יוביל לתוצאות שליליות. כמו כן, ודא ריאגנטים ותמיסות נשמרים מקוררים עד לשימוש כדי למזער את אות הרקע. התחל על ידי הפעלת מוצרי מחשוף ריבוזימים על ידי הוספת חמש יחידות של קינאז פולינוקלאוטיד T4 בצינור PCR.
לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של חיץ ריבוזימי 5X מוכן מראש לכל צינור דגימה. כדי להדגים באופן חזותי ספציפיות, הוסף 1.5 מיקרוליטר של שני מילימולרים תאופילין או שני מילימולרי קפאין לכל מבחנה כדגימות הבדיקה וערבב כל דגימה ביסודיות על ידי פיפטינג חמש עד 10 פעמים. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של 600 ננו-מולרי RNA המכיל תחום aptameric ספציפי למטרה לכל צינור דגימה, ולאחר מכן pipetting כדי לערבב את הרכיבים במהירות.
כעת, הניחו את הצינור על בלוק קר כדי למזער את אות הרקע. לאחר הכנת כל צינורות התגובה, דוגרים על כל דגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות בדיוק. בתום הדגירה, החזירו מיד את מבחנות הדגימה לקרח.
הוסיפו 3.5 מיקרוליטר של תערובת אנזימי ניקזה פולימראז לכל צינור דגימה וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסף 31.5 מיקרוליטר של תערובת תגובת EXPAR המכילה נוקלאוטידים של תבנית ומאגר תגובה לכל צינור דגימה וערבב על ידי פיפטינג. לאחר הכנת כל הדגימות, יש לדגור על הדגימה המוכנה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות באמצעות טיימר.
מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח לאחר הדגירה. הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת hemin לכל צינור דגימה לפיתוח צבע וערבב היטב. לאחר מכן, הוסף 58 מיקרוליטר של פתרון TMB הזמין מסחרית לכל צינור דגימה, לערבב היטב, ולדגור לפיתוח צבע.
קרא את הדגימות באופן איכותי בעין או כמת את התוצאות באמצעות קורא לוחות ספיגה, כמתואר בכתב היד. המבנה הממוטב יכול לזהות רק 500 ננו-מולרית תאופילין תוך 30 דקות. תכשירי דגימה הנחשפים למטרה מייצרים צבע כחול, בעוד דגימות שאינן מכילות מטרה נותרות חסרות צבע.
עקומה סטנדרטית הוכנה מהאות שנמדד ב-A450 לאחר 30 דקות של פיתוח צבע. חשוב לשמור דגימות על קרח כאשר לא מבצעים דגירה, שכן אפילו הרנ"א האופטימלי עדיין יציג רמת פעילות רקע נמוכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים בדיקת הגברה אקספוננציאלית מהירה בעלת שלושה שלבים המבוססת על אפטמרים, לזיהוי מטרות כגון theophylline. הוא כולל הכנת דגימות, הגברת אות ופיתוח צבע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- כימיה אנליטית
- ביוטכנולוגיה
רקע
- אפטמרים הם מולקולות קצרות של RNA או DNA בעלי גדיל אחד, המסוגלות להיקשר למטרות ספציפיות.
- הגבר אות הוא קריטי לגילוי מטרות בריכוז נמוך.
- שיטות גילוי ויזואליות עשויות להועיל בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- טיפול מדויק בריאגנטים חיוני לקבלת תוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה לזיהוי תאופילין בנוכחות קפאין.
- אספקת פרוטוקול "סיר אחד" (one-pot) להגברת אות.
- אפשרות לכימות התוצאות באמצעות עקומת כיול.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפעלה של תוצרי שסועי הריבוזים באמצעות T4 polynucleotide kinase.
- זיהוי חזותי של אירועי קישור.
- כימות באמצעות מכשור מבוסס בליעה (absorbance).
- ערבוב וקירור זהירים של ריאגנטים כדי למזער את אות הרקע.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת זיהוי של theophylline בדגימות.
- ניתן לפרש את התוצאות באופן חזותי או לכמת אותן.
- דיוק בטיפול בתמיסות הוא קריטי להשגת תוצאות מוצלחות.
- ניתן להפחית אותי רקע באמצעות ניהול נכון של הריאגנטים.
מסקנות
- הבדיקה המבוססת על אפטמר היא שיטה מהירה ויעילה לזיהוי המטרה.
- ניתן להתאימה ליישומים שונים בסביבות בעלות משאבים מוגבלים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון מטרות נוספות ואופטימיזציה של הפרוטוקול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות זיהוי מבוססות אפטמר עם הגברה אקספוננציאלית איזותרמית מציעות תוצאות מהירות, רגישות וניתנות לפירוש חזותי עבור תיקוף מטרות בתהליכי גילוי מוקדמים. פרוטוקול הגברה זה של G-quadruplex בשלושה שלבים מאפשר קריאות איכותניות וכמותיות, ובכך תומך בקבלת החלטות מוצקה בנקודות התפנית של פיתוח ובדיקה של המהלכים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במעורבות המטרה ובספציפיות, ובכך משפיעה ישירות על תעדוף הפורטפוליו ועל המוכנות של בדיקות השלב הבא.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של אירועי זיהוי מולקולרי באמצעות סגוליות של אפטמרים.
- תומך בתיקוף תפקודי של קישור למטרה באמצעות פלטים הניתנים לזיהוי חזותי.
- מקל על הערכה מהירה של מעורבות המטרה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- משפר את רמת הביטחון בסלקטיביות למטרה על ידי הבחנה בין אנליטים בעלי דמיון רב.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקול סטנדרטי של "סיר אחד" (one-pot) להקמה הדירה של הבדיקה.
- מספק פלטים כמותיים באמצעות מדידת בליעה להערכה מהימנה של תרכובות.
- מאפשר סריקה מהירה של דגימות עם דרישות מינימליות לציוד.
- תומך בכימות המבוסס על עקומת כיול לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מציע פוטנציאל להתאמה לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה, כאשר הדבר נתמך על ידי עיצוב האפטמר.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פורמטים של זיהוי הניתנים להרחבה.
- מפחית את הסיכון לתוצאות חיוביות שגויות על ידי מזעור אות הרקע באמצעות פרוטוקולים מותאמים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
מערכת aptamer-EXPAR זו משתלבת ברצף שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המוביל, ומספקת גשר מזיהוי מולקולרי לפיתוח בדיקה כמותית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי אישור נוכחות ומספריות של המטרה.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, המתאימות לסביבות בעלות תפוקה גבוהה או למסגרות עם משאבים מוגבלים.
- אנליזה: מאפשרת מדידה מבוססת בליעיות ויצירת עקום סטנדרטי לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: ניתן להסבה לזיהוי סמנים ביולוגיים במידה ונקבעה סגוליות האפטמר.
- שימוש חוזר ארגוני: המודולריות של הפרוטוקול מאפשרת התאמה למטרות חדשות באמצעות החלפת דומיינים של האפטמר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה באמצעות פרוטוקול מהיר, סטנדרטי וניתן להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך או עצירה של התהליך (go/no-go) ופיתוח בדיקות יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון באמצעות אספקת נתוני זיהוי כמותיים חסונים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתכנון אפטמרים וטיפול בחומצות גרעין.
- נדרשת גישה לציוד בסיסי של ביולוגיה מולקולרית וקוראי פלטות למדידת ספיגה לצורך כימות.
- נדרש טיפול מדויק בריאגנטים ובקרת טמפרטורה כדי למזער את אות הרקע.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למטרות שונות על ידי שינוי הדומיין האפטמרי.
- אופטימיזציה קפדנית נחוצה כדי להבטיח ספציפיות ולמזער תוצאות חיוביות שגויות.
