בדיקת ספוט ריק בזמן אמת

השיטה המתוארת בדו"ח זה יכולה לשמש להבנת היבטים פיזיולוגיים ונוירו-התנהגותיים של מיצוי מרצון במצבי בריאות ומחלות. טכניקה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר התנהגות עוצמת הקול של העכבר בשלבים הבהירים והכהים של היום, ומספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי התרוקנות. כדי להכין בדיקת נקודה ריקה בזמן אמת או תא הקלטה RT-VSA, הניחו נייר סינון דק או עבה, בהתאם לשעה ביום, בתחתית כלוב ההקלטה RT-VSA.

על גבי נייר הפילטר, הניחו איגלו פלסטיק לחלל שינה;צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל למטרות העשרה;וכלי פלסטיק בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ המכיל שתיים או שלוש חתיכות של צ'או יבש עכבר;ו 14 עד 16 גרם מים בצורת חבילת ג'ל. ברגע שתא ההקלטה מוכן, הנח בעדינות את העכבר על נייר הסינון. ודא כי העברת העכבר מכלוב הדיור לכלוב ההקלטה מתרחשת עם מתח מינימלי.

ברגע שהעכבר נמצא בתוך כלוב ההקלטה, הניחו את המכסה וכסו את החלק העליון של המכסה בפד כחול ספסל סופג כדי למזער השתקפויות אור סביבתיות ישירות על משטח מכסה הפרספקס. הפעל את האורות האולטרה סגולים בחדר התחתון. כדי להקליט וידאו RT-VSA מהמצלמות העליונות והתחתונות, השתמש בתוכנת הקלטת מעקב וידאו המוגדרת להקליט בו זמנית ממצלמות אינטרנט מרובות או ממצלמות רשת.

התחל הקלטה על ידי לחיצה על Cmd R בחלון התוכנית. בצע הקלטות וידאו בפריים אחד לשנייה. מיד לאחר תחילת ההקלטות, יש לצאת מהחדר ולסגור את הדלת בעדינות.

ודא שהחדר נשאר שקט במשך כל הניסוי. עצור את ההקלטות על ידי לחיצה על Cmd T.כבה את האורות האולטרה סגולים. לאחר עצירת ההקלטה, התוכנה יוצרת באופן אוטומטי קובץ סרט בפורמט m4v עבור כל מצלמה ושומרת אותו תחת שם המצלמה בתיקיית יעד שנבחרה בעבר.

ודא שבתוך כל תיקייה של מצלמה הניסויים מאורגנים בתיקיות לפי תאריך. בכל תיקיית תאריך או ניסוי, ודא שיש קובץ m4v אחד ואת כל קובצי jpeg הנפרדים המתאימים לכל מסגרת סרט. צור תיקיה בשולחן העבודה עם השם והתאריך של הניסוי והעבר את קבצי m4v לתיקיה זו.

העתק את תיקיית הסרט לכונן הבזק לניתוח במחשב חיצוני. פתח קובץ סרט שנאסף על-ידי המצלמה התחתונה במהלך הפאזה הבהירה או על-ידי המצלמה העליונה במהלך הפאזה החשוכה לצורך ניתוח. לאחר הערכת איכות הסרט, נתח ניסויים על ידי מעבר לחלון הזמן הנכון באמצעות הפקודה הרץ קדימה או מחוון סרגל הזמן.

פעילות ההתרוקנות בשלב האור נרשמת בין השעות 11:00-17:00, ובשלב החשוך, בין חצות ל-6:00 בבוקר. הפעל את הסרט במצב הרצה קדימה על ידי לחיצה על סמל הרץ קדימה או גלול ידנית לאורך הסרט, בחיפוש אחר ראיות לכך שהעכבר מתבטל. חפשו את הופעתם הפתאומית של כתמי שתן בהירים על נייר הסינון או את השינויים ההתנהגותיים, כולל תנועה לפינות הכלוב ופרק זמן קצר של חוסר פעילות כאשר העכבר מתרוקן. רשום את הזמן שבו מתרחש כל ריק.

כמוסכמה, זמן הריק נרשם בסימן הראשון שהשתן מזוהה. כדי למדוד את החלל, השתמש תחילה בפס הגלילה כדי לנוע קדימה או אחורה בזמן, וחפש את הנקודה שבה התרחשה דיפוזיה מקסימלית של נקודת השתן. השהה את הסרט בשלב זה והצב את חץ עכבר המחשב בנקודה הנמצאת בניתוח כדי לסמן את נקודת העניין בצילום המסך.

תן שם לקובץ צילום המסך באמצעות מספרים מתאמים כדי להסביר את סדר ההופעה בסרט. לאחר ניתוח כל כתמי הריק, מדוד את השטח הכולל של נייר הסינון על-ידי לכידת צילום מסך וסימון הגבול של נייר הסינון. חשב את שטח האחוזים של כל אחד מכתמי השתן.

המר את ערכי אזור האחוזים לנפח השתן עבור כל נקודת ריק באמצעות עקומות הכיול ופונקציית האינטרפולציה בתוכנת הגרפים. התנהגות ההתרוקנות של עכברי Piezo1, 2, נוקאאוט ובקרה תועדו בשלב החשוך והבהיר של היום. במהלך שלב האור הלא פעיל שלהם, לא נצפו הבדלים משמעותיים בפרמטרים כלשהם שנותחו עבור עכברי נוקאאוט נקבות או זכרים בהשוואה לקבוצת הביקורת.

עם זאת, בשלב האפל הפעיל, עכברי נוקאאוט נקבות וזכרים הראו שינוי בפנוטיפ ההתרוקנות, המאופיין בעלייה משמעותית במספר ובנפח הכולל של כתמי ריק קטנים. לא היו הבדלים משמעותיים בכתמים ראשוניים או במספר PVS, נפח ממוצע ל-PVS או נפח PVS כולל בעכברי נוקאאוט נקבות או זכרים בהשוואה לעכברי הביקורת. התנהגות ההתרוקנות של נקבות עכברים נבדקה בתנאי בסיס ולאחר טיפול בציקלופוספמיד.

בהשוואה לתנאים הבסיסיים, כמות שחרור השתן לכל חלל קטנה יותר לאחר טיפול cyclophosphamide ואת אירועי micturition הם הרבה יותר תכופים. היבט מרכזי אחד לשחזור הבדיקה הוא לתפעל את בעלי החיים בעדינות ככל האפשר ולשמור אותם תחת לחץ מינימלי במהלך כל תקופת הבדיקה. מכיוון שמדובר בבדיקה לא פולשנית, ניתן לבצע לאחר מכן פרוצדורות נוספות כולל ציטומטריה ואלקטרומיוגרפיה להערכת תפקודי סוגר שלפוחית השתן והשופכה החיצונית בהתאמה.

יישום טכניקה זו יאפשר לחוקרים להגדיר את תרומתם של מסלולים ספציפיים להתנהגות מתרוקנת במצבי בריאות ומחלות.