מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד
14 באפריל 2023
פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.
בעוד ליפופוסצין מצטבר באופן אוניברסלי ב-RPE עם ההזדקנות, קשה להבחין ברעילות שלו. כאן, אנו מפתחים פרוטוקולים המאפשרים לנו לפתח הצטברות דמוית ליפופוצין בתרביות RPE מאוד מקוטבות ובשלות כדי לעזור להבחין בהשפעות של ליפופוסצין על הפיזיולוגיה של RPE. חקר רעילות ליפופוסצין בבני אדם מבולבל על ידי העובדה כי lipofuscin פוחת ככל RPE מת.
מודלים של בעלי חיים של רעילות ליפופוסצין השיגו תוצאות שונות מאוד. יצרנו בקפידה מודלים במבחנה של הצטברות חומר דמוי ליפופוסצין כדי להקל על המחקר של רעילות ליפופוסצין. המפתח להצלחת המודלים שלנו הוא שמירה על תרבויות מובחנות מאוד תוך גרימת היווצרות ליפופוסצין באמצעות אותו תהליך שמפעיל ליפופוסצין in vivo, כלומר פגוציטוזה של מקטעים חיצוניים של קולטני אור.
פרוטוקול המבחנה שלנו ייחודי בכך שחומר דמוי ליפופוצין מצטבר בתרביות RPE המובחנות מאוד כדי לחקות נאמנה RPE in vivo. בנסיבות אלה, מצאנו כי תרבית RPE עמידה מאוד להצטברות ליפופוסצין ולהשפעה רעילה מליפופוצין. בנוסף, בתהליך הבדיקה לפנוטיפים הנגרמים על ידי הצטברות דמוית ליפופוסצין בתרביות RPE שלנו, יצרנו סוג חדש של בדיקת פאגוציטוזה הנקראת Total Consumptive Capacity.
בדיקה זו מאפשרת לנו לקבוע את כל היכולת של RPE למקטעים חיצוניים של פגוציטוזה תוך הימנעות מכמה מהפרשנויות המבלבלות שמגיעות עם מבחני פגוציטוזה קלאסיים של מרדף דופק. אנו נרגשים להשתמש במודל זה של הצטברות חומר דמוי ליפופוצין כדי להבין טוב יותר אילו גורמי לחץ RPE עשויים לקחת ליפופוסצין אינרטי בדרך כלל לתפקיד פתולוגי יותר במוות של תאי RPE.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בהשפעות של הצטברות ליפופוסין בתרביות של אפיתל רשתית (RPE) אנושי המאופיין בדפרנציאציה גבוהה, ומספק תובנות לגבי הרעילות של הליפופוסין והקשר שלו לפיזיולוגיה של ה-RPE. המחקר מציג פרוטוקולים חדשניים המשפרים את חקר השפעות הליפופוסין, תוך שימוש בבדיקת פגוציטוזה חדשנית להערכת קיבולת הצריכה הכוללת של המקטעים החיצוניים על ידי ה-RPE.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של התא
- פיזיולוגיה של הרשתית
- ניוון רשתית תלוי גיל
רקע
- הצטברות של ליפופוסצין (Lipofuscin) מתרחשת ב-RPE עם הגיל, מה שמסבך את הערכת הרעילות.
- מודלים in vitro משחזרים הצטברות דמוית-ליפופוסצין לצורך מחקרי רעילות.
- שמירה על תרביות RPE מובחנות היא קריטית למידול מדויק.
שיטות שהשתמשו בהן
- הצטברות in vitro של חומר דמוי ליפופוסקין בתרביות RPE בוגרות.
- מודלים של תאי אפיתל של הרשתית האנושית.
- בדיקת קיבולת בליעה כוללת של פגוציטוזה.
תוצאות עיקריות
- פיתוח תרביות RPE בעלות בידול גבוה העמידות לרעילות של ליפופוסין.
- בדיקה חדשה המאפשרת הערכה מחדש של יעילות הפגוציטוזה של המקטע החיצוני.
- זיהוי התנאים שבהם ליפופוסין הופך לפתוגני.
מסקנות
- המחקר מדגים את הפוטנציאל של מודלים in vitro לחקר גורמי עקה של ה-RPE הקשורים לליפופוסין.
- הממצאים תורמים להבנת מנגנוני ניוון הרשתית ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מידול מדויק של הצטברות ליפופוסין ופגוציטוזה בתרביות של אפיתל הרשתית (RPE) אנושי סוגר פער קריטי בהבנת ניוון הרשתית הקשור לגיל ומחלת סטארגארדט (Stargardt's disease). הצגת מודלים של RPE בעלי диффереנציאציה גבוהה ובדיקות כמותיות מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית וביטחון חיזוי עבור גילוי תרופתי בשלבים מוקדמים. התקדמויות אלו תומכות בהחלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי הבהרת מסלולים רלוונטיים למחלה ותיקוף תפקודי של מטרות בביולוגיה של הרשתית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מנגנוני הרעילות של ליפופוסין במערכות RPE אנושיות רלוונטיות פיזיולוגית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מידול של מסלולי פגוציטוזה ופירוק הרלוונטיים למחלה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור התערבויות מועמדות המכוונות לתפקוד לקוי של ה-RPE.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק תרביות RPE מקוטבות מאוד ומאומתות לצורך סריקת תרכובות הניתנת לשחזור.
- מציג בדיקות כמותיות של "Total Consumptive Capacity" למדידה חסונה של יעילות הפגוציטוזה.
- מאפשר סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה (scalability) לסריקה בתוכן גבוה (high-content screening) של מודולטורים של תפקוד ה-RPE.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים במבחנה (in vitro) לבין נקודות סוף רלוונטיות למחלה שנצפו בניוון רשתית אנושי.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי כימות של ליקוי בתפקוד הפגוציטי הקשור להצטברות ליפופוסין.
- משפר את הקידום המותאם לסיכון של מועמדים טיפוליים המכוונים לבריאות ה-RPE.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מתודולוגיה זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובכך מספקת רצף למחקרים מכניסטיים ולסריקה כמותית במודלים של מחלות רשתית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות בנוגע לרעילות של ליפופוסצין ומסלולי גורמי עקה של RPE.
- סריקה: מספקת בדיקות פגוציטוזה כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות של דימות ספקטרלי ו-Western blot לצורך ניתוח השוואתי של תפקוד RPE.
- מחקר תרגומי: מגשר בין תובנות מכניסטיות in vitro למודלים פרה-קליניים של מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מידול מחלות הקשורות ל-RPE ופיתוח בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות רטינליות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקילביליות של בדיקות RPE.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפורטפוליו רטינלי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של תוכניות טיפוליות המכוונות ל-RPE.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפרוטוקולי תרבית ודיפרנציאציה של תאי RPE אנושיים.
- דורש גישה לתשתית אנליטית של דימוי קונפוקאלי ו-Western blot.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של בדיקות כימות פגוציטוזה ואוטופלואורסצנציה.
- ייתכן שיהיה צורך בביצוע התאמות עבור מקורות שונים של RPE או מודלים של מחלות.
- פרשנות של רעילות ליפופוסין תלויה במודל וייתכן שאינה משחזרת באופן מלא את המורכבות ב-in vivo.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:42
Preparation of Photo‐Oxidized Outer Segment Tips and Fragments
6:27
Characterization of the Lipofuscin‐Like Granule Spectrum and Composition
8:26
Assessing the Effects of Lipofuscin‐Like Granules on RPE Phagocytosis: Total Consumptive Capacity
