שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 ביוני 2023
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.
L.Reuteri, ובמיוחד הזן, DSM20016 הוא מערכת מעיים אנושית חזקה וטבעית, עם הבטחה גדולה להעברה טיפולית ולגילוי מחלות בכל מערכת העיכול. עבודה זו תסייע למצב את DSM20016 כמארז ביולוגיה סינתטית עבור יישומים מסוג זה. לקטובציללים אין אורגניזם מודל ספציפי.
מינים מועדפים אכן קיימים, אך הם נבחרים בדרך כלל עם הטיה למטרות מחקר מסוימות. השונות בתוך משפחת החיידקים הובילה לפרוטוקולים מקוטעים, חלקם עם איטרציות של שינויים שחזרו דרך פרסומים. קשה מאוד לאנשים בתחילת דרכם לסנן בדיוק מה שימושי ומה לא.
מאמר אחד לשינוי DSM20016 אכן קיים, אבל הוא לא מודרני. פרוטוקולים מודרניים עבור בני משפחה אחרים Lactobacillales קיימים, אבל הם לא DSM20016. כאן אנו שואפים לספק קל לשימוש, מרכזי, מודרני, סט שלם של פרוטוקולים עבור אלקטרופורציה DSM20016.
סט פרוטוקולים זה מציע מודרניזציה משמעותית על פני פרוטוקול חקר DSM20016 קודמים, ומבהיר כמה חוטים תלויים, כמו גם מדגיש חלקים שהיו בעבר פחות ברורים. ערכת הפרוטוקולים מלאה גם היא, ובמיוחד עבור DSM20016, זן שפרוטוקולים אחרים שאינם DSM20016 אינם תואמים לחלוטין. אחת המטרות העיקריות שלנו היא שימוש במיקרובים כחיישנים זולים ומערכות הולכה.
אנו עובדים עם מומחים למחלות מעיים כדי להשתמש DSM20016 כדי לחוש את התנאים במערכת העיכול ולספק טיפולים לפי הצורך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, חיידק קומנסלי חסון ממעי האדם. הפרוטוקולים כוללים גידול, טרנספורמציה של פלסמיד, Colony PCR ומדידת חלבון רבסור פלואורסצנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה סינתטית
- בריאות מערכת העיכול
רקע
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 הוא חיידק קומנסאלי טבעי במעי האדם.
- זן זה מבטיח פוטנציאל להעברה טיפולית ולגילוי מחלות.
- פרוטוקולים בתחום זה הם לרוב מקוטעים וקשים לניווט.
- מטרות המחקר עלולות להטות את בחירת מיני החיידקים.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקולים ברורים לעבודה עם DSM20016.
- הקלה על מדידת חלבוני דגימה (reporter proteins) ואישור באמצעות colony PCR.
- מתן מענה לבעיות נפוצות ופתרון תקלות בפרוטוקולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- טכניקות לטרנספורמציה של פלסמיד.
- PCR של מושבות לאישור של מוטציות גנטיות.
- מדידה של חלבוני דווח פלואורסצנטיים.
תוצאות עיקריות
- הוקמו פרוטוקולים יעילים לגידול ולטרנספורמציה.
- בדיקת Colony PCR אישרה את נוכחותן של המבנים הגנטיים הרצויים.
- חלבונים פלואורסצנטיים משמשים כחיווי נמדדו ביעילות.
- סופקו הנחיות לפתרון בעיות עבור תקלות נפוצות.
מסקנות
- הפרוטוקולים משפרים את השמישות של DSM20016 במחקר.
- הם מספקים תשתית ליישומים עתידיים בביולוגיה סינתטית.
- הנחיות ברורות מסייעות לחוקרים לנווט בספרות מקוטעת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקולים מרכזיים ומסוכים למסלול ספציפי של אלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה עבור Limosilactobacillus reuteri DSM20016 נותנים מענה לפער קריטי בפיתוח שלטות (chassis) בביולוגיה סינטטית ליישומים המכוונים למעי. תהליכי עבודה סטנדרטיים מפחיתים עמימות ומאפשרים הנדסה הדירה של מיקרובים קומנסליים לצורך הובלה טיפולית וזיהוי מחלות. הדבר ממצב את DSM20016 כפלטפורמה אמינה למחקר ופיתוח בביופארמה בשלבים מוקדמים המכוונים לבריאות מערכת העיכול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מניפולציה גנטית חסונה של DSM20016 לצורך בחינה פונקציונלית של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת היתכנות הטרנספורמציה בזן קומנסלי מרכזי.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת זנים עבור תהליכי ביולוגיה סינתטית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק פרוטוקולים מתוקפים להכנת DSM20016 כשלדה (chassis) מוכנה לסריקה.
- מבצע סטנדרטיזציה של התהליך של טרנספורמציה ומדידת רפורטר לקבלת תוצאות בדיקה הניתנות לשחזור.
- מאפשר הערכה מהימנה של מבנים הנדסיים במערכת הרלוונטית למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את ה-DSM20016 ההנדסי למטרות תרגומיות של הובלה טיפולית המכוונת למעי.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במודלים של מערכת העיכול.
- מפחית את הסיכון בקידום קומנסאלים הנדסיים לעבר מחקרים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקולים אלו משתלבים בממשק שבין הגילוי המוקדם לפיתוח הבדיקה, ובכך מאפשרים התקדמות יעילה מהנדסה גנטית לסריקה תפקודית ב-DSM20016.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהנדסת מסלולים בתוך שלדה קומנסלית.
- סריקה: מספק טרנספורמציה הניתנת לשחזור ותוצאות כמותיות של רפורטר עבור תהליכי עבודה המשכיים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של יעילות הטרנספורמציה וביטוי הרפורטר לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מספק בסיס להערכה פרה-קלינית של זנים מהונדסים בהקשרים רלוונטיים למעי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס את DSM20016 כפלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר עבור מו"פ בביולוגיה סינתטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בהנדסת חיידקים קומנסליים.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולים סטנדרטיים, ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב למניפולציה של זנים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתוכניות מוקדמות של מיקרוביומ המעי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תרפיה מיקרוביאלית מהונדסת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של מיקרואורגניזמים ובטכניקות של אלקטרופורציה.
- דורש גישה לציוד אלקטרופורציה ומכשור של קורא לוחות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך אימוץ הפרוטוקול ופתרון בעיות.
- עשוי לדרוש התאמה עבור זני Lactobacillales אחרים בשל שונות גנוטיפית.
- תאימות הפרוטוקול ספציפית ל-DSM20016 וייתכן שלא תהיה תקפה לזנים אחרים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
