מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

מטרת המחקר היא להעריך את תפקוד טסיות הדם בתנאים פיזיולוגיים. אנו חוקרים באופן ספציפי את תפקוד טסיות הדם באמצעות התקנים מיקרופלואידים ומשטחים ביולוגיים. ובאמצעות גישה זו, הצלחנו לענות על שאלות הקשורות לתפקוד לקוי של טסיות הדם והחייאה המוסטטית ליישומים ברפואת עירוי.

בדיקות תפקוד טסיות הדם הנוכחיות בודקות לעתים קרובות את יכולתן של טסיות להצטבר בתגובה לאגוניסט ספציפי לפי בחירה. שיטות זיהוי עשויות לכלול העברת אור או עכבה חשמלית, ובדיקות אלה עשויות להשתמש בדגימות תהליך, והן נבדקות באופן עומד. על ידי שימוש בגישה מיקרופלואידית זו לבדיקת תפקוד טסיות הדם, אנו משלבים דינמיקת נוזלים כדי להוסיף רלוונטיות פיזיולוגית.

דינמיקה של נוזלים ממלאת תפקיד קריטי במנגנונים ביולוגיים המעורבים בתפקוד טסיות הדם במהלך המוסטאזיס. במטופלים מדממים, אנו מודאגים במיוחד מתפקוד טסיות הדם, ומהתערבויות טיפוליות שעשויות לשפר תפקוד זה לקבלת תוצאות טובות יותר. באמצעות גישה זו של בדיקת תפקודי טסיות, אנו יכולים לעקוב אחר התרומות של אוכלוסיות טסיות שונות בניסוי ולפתוח דרך להעריך אפשרויות טיפוליות לטראומה ומצבי דימום אחרים.

כדי להתחיל, יוצקים את בסיס אלסטומר הסיליקון לתוך צלחת שקילה. מוסיפים את חומר ריפוי הסיליקון ביחס של עשרה לאחד ומערבבים היטב את התערובת כדי להבטיח קישור צולב תקין של שרשראות פולימר הסיליקון. הכניסו את תבנית האב לצלחת פטרי ושפכו את ה-PDMS שלא נרפא על התבנית באופן שווה.

לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי בתוך מייבש ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות מהתערובת. כדי לסיים לרפא את PDMS, מניחים את התבנית לתוך תנור להגדיר 70 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר ריפוי PDMS מלא, השתמש בסכין גילוח או אזמל כדי לחתוך את הגבס microfluidic.

ניקוב חורים בשולי הערוצים. כעת, הניחו את מגלשת הזכוכית ואת הגבס המיקרופלואידי עם הצד החרוט כלפי מעלה לתוך מנקה פלזמה. הפעל את משאבת הוואקום ואטם את התא.

לאחר מכן, סובב את שואב הפלזמה להגדרה גבוהה והשאר את ההתקנה בשואב למשך 30 שניות. לאחר מכן, לכבות את שואב פלזמה ולשחרר את השואב. כדי לקשור את הגבס ומגלשת הזכוכית שנוקו בפלזמה, לחצו בעדינות על הצדדים שפנו כלפי מעלה במנקה הפלזמה יחד.

מניחים את המכשיר microfluidic בתנור או על צלחת חמה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לסיים את תהליך הקשירה. כעת, צפו את התא המיקרופלואידי בריאגנט קולגן פיברילרי מסוג אחד דרך שקע ייעודי לכניסה המיועדת. אחסנו את המכשיר בכלי חם, לח וסגור כדי למנוע מהקולגן המצופה להתאדות בתוך התעלה.

לאחר שעה, שטפו את המכשיר עם PBS בכיוון ההפוך לציפוי כדי לשטוף את תמיסת הקולגן. כדי להתחיל, לדגור דם שלם ציטרציה עם נוגדן CD41 מצומד פלואורסצנטי, באמצעות פלואורופור של בחירה. מכתימים את הדם למשך 30 דקות על נדנדה מטורפת.

לאחר מכן, הפעל את המיקרוסקופ ואת התוכנה המשויכת. הגדר את רמת משאבת מזרק הגמילה בשלב המיקרוסקופ והתאם את הגדרות משאבת המזרק בהתאם לדרישות הניסוי. לאחר מכן, הניחו את המכשיר המיקרופלואידי על במת המיקרוסקופ והדביקו את קצותיו לבמה כדי למנוע תנועה.

כעת, חבר את הצינור בקוטר 16 אינץ 'למחבר מרפק, ולאחר מכן למזרק 10 מיליליטר עם מחבר בקוטר 16 אינץ 'פנימי. ממלאים את מזרק ה-10 מיליליטר ב-PBS סטרילי ומחברים אותו למשאבת המזרק. לאחר מכן, הכנס את מחבר המרפק לשקע המכשיר המיקרופלואידי.

הכינו קווי כניסה באורך של כ-10 ס"מ עם מחבר מרפק בקצה אחד וחתך זוויתי בקצה השני. כעת, חבר את מחבר מרפק הכניסה לכניסת המכשיר ומקם את קו הכניסה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה פסולת המונח על מחזיק זוויתי. השתמש בעדשה האובייקטיבית פי 10 כדי להתמקד בקצוות ערוץ ההתקן המיקרופלואידי.

לאחר מכן, פריים את הקווים עם PBS. קדם ידנית את משאבת המזרק כדי לנקות את התעלה מכל PDMS או פסולת. בדוק ליד כניסת הערוץ והיציאה אם יש חסימות.

כעת, פתח את הגדרות לכידת התמונה שנשמרו או צור הליך לכידת תמונה חדש עבור תמונות מסדרות זמן שצולמו כל שנייה עד שתיים עם ערוץ שדה בהיר וערוצים פלואורסצנטיים המתאימים לנוגדני CD41 בדגימת הדם. קבל את דגימת הדם ציטרט מסונן ולערבב אותו על ידי pipeting למעלה ולמטה ממש לפני תחילת הניסוי. מניחים את הדגימה על מחזיק מיקרוצנטריפוגה זוויתית.

לאחר מכן, מקם את קו הכניסה לתוך דגימת הדם והתחל להקליט את לכידת התמונה. משכו באיטיות את המזרק כדי למלא את הנפח המת בצינורית. ברגע שהדם מגיע לערוץ, לחץ מיד על הפעל על משאבת המזרק כדי לחדש את הזרימה בקצב הרצוי.

הפעל את הניסוי עד שהטסיות הסתירו לחלוטין את האזור הסטנוטי של המכשיר המיקרופלואידי, או עד לנקודת הסיום של הניסוי, שהיא בדרך כלל 10 דקות. לאחר השלמת הניסוי, עצור את לכידת התמונה ועצור את משאבת המזרק. לבסוף, שמור את לכידת התמונה באחסון המתאים.