Microfluidic זרימה צ'יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי במבחנה
19 במרץ 2016
עירוי טסיות דם והמוסטזיס עוצבו באמצעות בנייה מחדש של דם ותאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לחקור את תפקוד טסיות הדם. הנתונים מדגימים את ההשלכות של נגע אגירת טסיות דם על המוסטזיס, במבחנה.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקות עירוי טסיות דם במבחנה ולבדוק אותו באמצעות המוסטזיס על קולגן, עם זרימה הידרודינמית ומיקרוסקופיה בזמן אמת. חולים עם טרומבוציטופניה מטופלים בתרכיזי טסיות מאוחסנים. השיטה שלנו נועדה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפקקת וההמוסטזיס, עם דגש ספציפי על האיכות והתפקוד של תרכיזי טסיות מאוחסנים כאלה.
הערך המוסף של טכניקה זו הוא שהיא מחקה את זרימת הדם, ובכך לוקחת בחשבון השפעות ריאולוגיה על תאים וביו-מולקולות משתתפים. השיטה הנוכחית מעריכה את קשירת טסיות הדם לקולגן. עם זאת, ניתן ליישם אותו גם על רקמות דבק אחרות, כולל רובד טרשת עורקים, תאי אנדותל או חלבוני מטריצה ספציפיים כמו פקטור פון ווילברנד ופיברינוגן.
התחל בהכנת השבב. מערבל ומדלל מלאי קולגן 1 עד 20 בתמיסת הגלוקוז האיזוטונית של היצרן לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, פיפטה 0.8 מיקרוליטר לנתיבים של שבב ביולוגי חד פעמי חדש.
מלא את כל הנתיבים בקצה אחד של השבב, וסמן זאת כקצה היציאה. לאחר מכן בדוק את השבב כדי לוודא שכל נתיב מלא 5/6 מהדרך בתמיסה, וללא בועות אוויר. לאחר מכן, דגרו את השבב בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות או למשך הלילה בכלי לח וסגור.
מאוחר יותר, חסום את הערוצים המקודדים על ידי פיפטינג חוסם חיץ לקצה השני של הנתיבים. לאחר מכן עבור כל נתיב, חתוך אורכי צינורות של 12 סנטימטרים, והצמד סיכה לכל אורך צינור כדי להפוך אותם לניתנים לחיבור לשבב. שוטפים את אורכי הצינור במים מזוקקים ממזרק ומחבר.
לאחר מכן, יש להרוות אותם במאגר חוסם ולאטום אותם בכלי לח למשך שעה לפחות. לאחר מכן, הכינו את המשאבה ואת הסעפת. ראשית, שטפו את המשאבה והסעפת במים מזוקקים כדי להסיר בועות אוויר.
לאחר מכן, חבר את השבב הביולוגי לשלב המיקרוסקופ האוטומטי. הכניסו קצה אחד של האורכים לצינור של 1.5 מיליליטר מלא ב-HBS, ואז חברו אותם עם הקצה השני לכניסות השבב. הכניסו את סיכות הסעפת לשקעי השבב
.לאחר מכן, שטפו את המערכת עם HBS באמצעות המשאבה. כל חיץ חוסם שנותר או קולגן שנדבק בצורה גרועה יוסר כך. זה משלים את הכנת תא הזרימה.
התחילו באיגום אוספי דם אחרונים ממתנדבים בריאים לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי. סובב את הדגימה למשך כ-15 דקות ב-250 Gs.Do לא להשתמש בבלם, מכיוון שהוא יפריע לשלב התחתון הארוז באופן רופף. הסר והשליך את הפלזמה העשירה בטסיות ואת מעיל האפי.
שמור את כדוריות הדם האדומות הארוזות המכילות כמה שפחות טסיות דם, כדי לייצר את הדם המחודש. כעת, התחל להפשיר ארבעה מיליליטר של פלזמה מסוג AB ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ו-20 שניות. בינתיים, קבע את ההמטוקריט של תאי הדם האדומים הארוזים המוכנים באמצעות מנתח המטולוגי אוטומטי.
לאחר מכן, קבע את ריכוז הטסיות של תרכיז טסיות הדם שהוכן בבנק הדם לשימוש לבנייה מחדש של כל הדם. חשב את הנפחים הנדרשים למיליליטר אחד של דם משוחזר עם 40% המטוקריט, ו -250, 000 טסיות דם למיקרוליטר. כעת, באמצעות קצה פיפטה קצוץ, העבירו את הנפח הנדרש של כדוריות דם אדומות, פלזמה ותרכיז טסיות לריכוז הרצוי, ונפח סופי של מיליליטר אחד.
מערבבים את הדם המחודש עם היפוכים עדינים, ומבצעים ספירת דם מלאה. לאחר מכן, קחו צינור מיקרו-צנטריפוגה מוכן המכיל Calcein AM, והוסיפו אליו מיליליטר אחד של דם משוחזר. מערבבים את הדם עם צבע באמצעות היפוכים עדינים.
לאחר מכן, דגרו על הדם המחודש למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בתוכנה, בחר את אזור העניין בנתיב הזילוף. התמקדו בסיבי הקולגן המודבקים בתחתית המסלולים בהגדלה של פי 100.
באופן אידיאלי, השתמש בניגודיות פאזה או בניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. בחר באפשרות Set Current Z עבור אזורי אריחים שנבחרו כדי לתקן דיגיטלית את מיקומי Z שנבחרו. המיקוד האופטי לפני הזלוף צריך להיות על קולגן אמלובלסטים, אבל זה יכול להיות מסובך.
חלופה היא לכוון את מוקד המיקרוסקופ לטסיות הדם הנצמדות הראשוניות. כעת, ערבבו בעדינות את הדגימות ומקמו אותן ליד השבב. לאחר מכן, הכניסו את הצינור המחובר לנתיב הנצפה לתוך הדם המחודש.
לאחר מכן, באמצעות התוכנה השולטת במשאבה, הפעל לחץ של 50 דיין לסנטימטר רבוע כדי להעביר את דגימת הדם לנתיב ולהתחיל את הניסוי. במהלך הניסוי, הקלט תמונות כל 15 שניות למשך חמש דקות. קבע את קינטיקה של צמיחת הפקקת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
במקרה זה, נעשה שימוש בזן 2012. התחל בפתיחת ניתוח תמונות התוסף כדי לקבוע את כיסוי פני השטח של טסיות הדם. הגדר את סף הקרינה בכרטיסייה האינטראקטיבית ניתוח כדי להגדיר את עוצמת הפיקסלים המתואמת עם אות חיובי, שיגיע מטסיות דביקות.
לאחר מכן, השתמש ביצירת טבלאות כדי ליצור באופן אוטומטי גיליון אלקטרוני עם רשימה של שטחי הפנים של האותות החיוביים עבור כל נקודת זמן. שמור גליונות אלקטרוניים אלה בתבנית XML ופתח אותם בתוכנית גיליון אלקטרוני לחישובים נוספים. בכל נקודת זמן, חשב את שטחי הפנים הכוללים של האובייקטים שנבחרו, ובטא ערך זה כאחוז המשטח המכוסה.
לאחר מכן, שרטט את הנתונים כפונקציה של זמן הזילוף, וחשב את השיפוע על ידי רגרסיה ליניארית. זה מדגים את קינטיקה של צמיחת פקקת של אותו מצב ניסוי מסוים. שלוש דגימות דם מלא זהות ששוחזרו הוחדרו בו זמנית על משטחים מצופים קולגן.
זה הביא למקדם שונות של 8.7%, מה שמרמז על שונות מקובלת בתוך הבדיקה ובתוך המעבדה להשוואת בדיקות. עירוי הדם היה מדומה על ידי בנייה מחדש של הדם עם המרכיב החסר. בוצעו מספר בנייה מחדש עם ירידה בריכוזי טסיות הדם.
כצפוי, ספירת טסיות נמוכה יותר הביאה לפחות הידבקות כפונקציה של זמן הזלוף. לאחר מכן נבדקה ההשפעה של ירידה בטמפרטורות לאחר איסוף הדם ובמהלך הזלוף. נמצא כי פקקת נבנית לאט יותר כאשר הדם מקורר לטמפרטורת החדר.
בהשוואה לדגימה שנשמרה על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל המחקר. בזמן המחזור, טסיות הדם נקשרות לאתרי פגיעה בכלי הדם בתנאים של לחץ מוגבר על הדופן. כצפוי, שינוי הקצב העצום בתאי הזרימה המיקרופלואידיים שינה את הידבקות הטסיות הכוללת.
תנאים אלה משנים גם את קינטיקה של צמיחת הפקקת. לאחר צפייה בסרטון זה, אדם אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויים בתא זרימה מיקרופלואידית באמצעות דם משוחזר כדי לבדוק את האיכות והתפקוד של תרכיזי טסיות מאוחסנים. ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבע שעות.
ניסויים בתא זרימה מיקרופלואידית סללו את הדרך לחוקרים בתחום עירוי טסיות הדם לחקור את ההשפעה של משתני תרומה, הכנה ואחסון. דוגמה רלוונטית אחת היא נטרול פתוגנים. נתנו דוגמה של נושא ניסוי אחד בלבד.
עם זאת, ניתן להשתמש בשינויים בריכוז הסידן, הלחץ המוחלט וציפויי פני השטח כדי לענות על שאלות מחקר שונות. בדומה להליך זה, ניתן לבצע מדידות אחרות בתאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לענות על שאלות נוספות. למשל הביצועים של טסיות מאוחסנות לקרישה בזרימה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן עירוי טסיות והמוסטזיס באמצעות רקבנה של דם ותאי זרימה מיקרופלואידיים. הוא מדגיש את ההשפעה של פגיעות האחסון של טסיות על התפקוד ההמוסטטי in vitro.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- המטולוגיה
- תרומבוזה
- המוסטזיס
רקע
- חולים עם תרומבוציטופניה מקבלים תרכיזי טסיות מאוחסנים.
- פגיעות כתוצאה מאחסון טסיות עלולות להשפיע על התפקוד ההמוסטטי.
- הבנת תפקוד הטסיות חיונית לשיפור תוצאות העירוי.
- שיטות נוכחיות מעריכות את האינטראקציות של טסיות עם קולגן ורקמות דביקות אחרות.
מטרת המחקר
- לדימוי עירוי טסיות באופן vitro.
- להערכת התפקוד ההמוסטטי על קולגן תחת זרימה הידרודינמית.
- לבדיקת האיכות והתפקוד של תרכיזי טסיות מאוחסנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות לשחזור דם.
- תאי זרימה מיקרופלואידיים עבור מיקרוסקופיה בזמן אמת.
- הערכת קישור טבחים לקולגן.
- יישום לרקמות דבקיות אחרות, כגון פלאק טרשילורוטי.
תוצאות עיקריות
- הדגים את השפעותיהם של נזקי אחסון (storage lesions) על תפקוד טבקיות.
- סיפק תובנות לגבי היכולות ההמוסטטיות של טבקיות מאוחסנות.
- הראה את הרלוונטיות של זרימה הידרודינמית להערכת אינטראקציות בין טבקיות.
- הדגיש יישומים פוטנציאליים לרקמות דבקיות שונות.
מסקנות
- המחקר מציע שיטה חדשנית להערכת יעילותן של עירויי טסיות.
- הממצאים עשויים להנחות פרקטיקות קליניות בנוגע לאחסון ולעירוי של טסיות.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את ההשלכות על תהליכי תרומבוזיס והמוסטזיס.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
פרוטוקול זה מאפשר לצוותי מו"פ בביופארמה להעריך את יעילותן של עישורי טסיות תחת תנאי זרימה רלוונטיים פיזיולוגית, ובכך הוא נותן מענה לפער קריטי בהערכה פרה-קלינית של איכות מוצרי דם. באמצעות סימולציה של המוסטזיס בתאי מיקרופלואידיקה תוך שימוש בדם ששוחזר, השיטה מספקת מדדים כמותיים בזמן אמת של תפקוד הטסיות התומכים בהחלטות go/no-go בפיתוח רפואה עישורית. גישה זו מפחיתה סיכונים בהתקדמות טרנסלציונית על ידי קישור משתני אחסון לתוצאות תפקודיות, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בביצועי מוצרי הטסיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות הנוגעות לתפקוד טבקיות ולהשפעת נזקי האחסון על ההמוסטזיס.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות בריכוזי טבקיות תחת תנאים מבוקרים של מאמץ גזירה וטמפרטורה.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי מוצרים על ידי קורלציה בין ריכוז הטבקיות, משך האחסון ומחזורי טמפרטורה לבין קינטיקת הצמיחה של קרישי דם.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקה המשכית של תרכובות המשפיעות על טסיות דם או להתערבויות באחסון.
- שחזור: מספקת מדידות כמותיות של כיסוי פני השטח עם שונות נמוכה בתוך הבדיקה (8.7% CV), מה שמאפשר הערכה מהימנה של התרכובות.
- מדרגיות: תומכת בבדיקה מרובת-דגימות של שלוש דגימות דם משוחזרות זהות בו-זמנית על פני שטח מצופים בקולגן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תרחישי טיפול בתרומבופניה באמצעות דם משוחזר כדי לחקות עירוי טסיות קליני.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישוש פרה-קליני על ידי מדידת תפקוד המוסטטי על קולגן תחת זרימה הידרודינמית.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע להחלטות על קידום השלב הבא על ידי כימות ההשפעה של תרומת דם, הובלה, הפרדה של רכיבים, אחסון ונטרול פתוגנים על תפקוד הטסיות.
שילוב תהליכי עבודה וסבבי עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת בחינה רציפה של איכות מוצרי טסיות לאורך שרשרת העיבוד.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי פגמים באחסון טסיות ובבירור מסלולי ההמוסטזיס בתנאי זרימה.
- סריקה: מספקת מערכות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה להערכת היצמדות טסיות וקינטיקה של צמיחת קרישי דם.
- אנליטיקה: מייצרת קינטיקה כמותית של צמיחת קרישי דם באמצעות ניתוח תמונה ורגרסיה ליניארית, המאפשרת השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי סימולציה של עירוי ומדידת תוצאות פונקציונליות בתנאי גזירה הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת לשימוש חוזר להערכת איכות מוצרי טסיות לאורך משתני אחסון ושלבי עיבוד מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתפקוד טבקיות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בהשפעות של נזקי אחסון.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולים מבוקרים של פרפוזיה, חסימה (blocking) והדמיה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי קישור משך האחסון, הטמפרטורה וקצב הגזירה לתוצאות תפקודיות של טבקיות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף מותאם סיכון של אופטימיזציות בעיבוד טבקיות בהתבסס על נתוני המוסטזיס אמפיריים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במיקרופלואידיקה, שחזור דם ומיקרוסקופיה בזמן אמת.
- תלוי בבמה אוטומטית של מיקרוסקופ, מערכת משאבות-מנקיפולד ובביוצ'יפים תואמים ביולוגית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של המטוקריט, ריכוז טסיות והגדרות לחץ פרפוזיה.
- כולל שיקולי התאמה לקצבי גזירה משתנים, פרופילי טמפרטורה וציפויים של פני השטח (למשל, collagen, VWF, fibrinogen).
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך במילוי תעלות ללא בועות אוויר ושמירה מדויקת על מיקוד Z במהלך הפרפוזיה.
