הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic
27 באוקטובר 2009
מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.
מערכת ה-bio flux היא מכשיר אוטומטי והתקן מיקרופלואידי להרצת בדיקות תאים חיים תחת זרימה גזירה (sheer flow) מבוקרת. מערכת זו משתמשת בטכנולוגיית מיקרופלואידיקה של פלטות בארות כדי לשלב התקני תאי זרימה בקנה מידה מיקרוני בתוך פלטות בארות בתקן SBS. ניתן להשתמש ב-BioFlex לביצוע מחקרי היצמדות ואגרגציה של טסיות דם בתפוקה גבוהה ובנפחי דם מופחתים.
דם מלא המסומן בצבע פלורסצנטי מתווסף לבארים ולאחר מכן זורם דרך התעלות. תחת זרימה עם מאמץ גזירה מבוקר, מופקים נתוני מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, המכמתים היצמדות ואגרגציה של טסיות דם בנוכחות תרכובות תרופתיות ופרמטרים משתנים אחרים. שלום, אני מייק שוורץ ממעבדת ה-RD ב-Flexion Biosciences.
היום נדגים לכם פרוצדורה לשימוש בתאי זרימה מיקרופלואידיים במבדקי היצמדות טסיות דם. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו למגוון של מבדקים בביולוגיה של כלי הדם. אז בואו נתחיל.
לפני ביצוע ניסוי תא הזרימה, יש להכין את הערוצים המיקרופלואידיים של פלטת ה-bio flux באמצעות ציפוי חלבון רלוונטי; בניסוי זה יעשה שימוש ב-collagen one. כל אחד מ-24 הערוצים הניסויים של פלטת ה-bio flux מחובר לבאר כניסה ולבאר יציאה של הפלטה. באר הכניסה היא הבאר השמאלית המזינה את הערוץ, ובאר היציאה נמצאת מימין; יש לדלל את תמיסת ה-collagen one לריכוז של 200 µg/mL.
בחומצה אצטית 0.02 מולרית, יידרשו 20 µL עבור כל תעלה בשימוש. מכיוון שניסוי זה דורש 11 תעלות, הכין 200 µL של ציפוי קולגן. תעלה אחת נותרת ללא ציפוי ומעורבבת על ידי חזרות עדינות עם קצה של מיקרופיפטה.
הוסף 20 µL של ציפוי לכל תעלה בהתאמה, באמצעות מיקרו-פיפט, על ידי הזרקה של הנוזל לחור הפנימי של הבאר. הזן את התעלה המיקרופלואידית הרלוונטית כפי שמוצג כאן עם הצבע הצהוב; כלול תעלה אחת ללא קולגן כביקורת שלילית להיצמדות ולסכיריות של טסיות דם. לאחר הוספת ציפוי הקולגן לכל התעלות הרלוונטיות, חבר את הממשק לצלחת.
אם אתם משתמשים בממשק bio flux 1000, ניתן לסגור את שני התפסים על הבמה. אם אתם משתמשים בממשק Bio flux 200, הדקו תחילה את ארבעת הברגים. לאחר שכולם מקובעים, השתמשו במפתח מומנט כדי להדק אותם באופן מלא.
מפתח המומנט ישמיע נקישה כאשר יגיע למקסימום. באמצעות מצב העבודה הידני בתוכנת ה-bio flux, יש להחיל פרפוזיה לערוצים הרלוונטיים ב-2D לסמ"ר מהיציאה. נשתמש בעדשה בעוצמה נמוכה במיקרוסקופ כדי למצוא את באר הכניסה ולצפות במילוי הנוזל בנקב הפנימי הנגדי.
ראשית, עליך להבחין בכמות קטנה של נוזל הממלאת באיטיות את הpunch הפנימי לאחר מספר דקות; כאשר הpunch הפנימי של פתח הכניסה מלא, הפסק את הזרימה בכל הערוצים על ידי לחיצה על stop בתוכנה. דגרי את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. במהלך תקופת דגירה זו, ניתן להתחיל בהכנת הדם השלם לקראת סיום שעת הדגירה.
לאחר הכנת הדם, הסר את הממשק והוסף מיליליטר אחד של PBS בתוספת יוני סידן ומגנזיום לבאר היציאה. התחל פרפוזיה מבאר היציאה בקצב של 2 dyn/cm² והמשך בפרפוזיה במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הפסק את הפרפוזיה. לאחר הסרת הממשק, הסר את עודפי ה-PBS הן מבאר הכניסה והן מבאר היציאה.
אין להסיר לעולם את הנוזל הממלא את הpunch הפנימי. כדי לחסום את התעלות, יש להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה לכל פתח יציאה. יש לבצע פרפוזיה מהבאר של פתח היציאה בקצב של two dine per centimeter squared ולהמשיך בפרפוזיה למשך 10 דקות.
הפסיקו את הזרימה לאחר 10 דקות והסירו את הממשק. התעלות מוכנות כעת וניתן להשתמש בהן לאורך היום בזמן שהפלטה מצופה בקולגן. במהלך דגירה של שעה אחת, יש להכין דם אנושי טרי מאדם בצום לצורך דימוי והזרמה לתוך הפלטה.
יש לדמות דם לתוך נתרן ציטראט, נוגד קרישה, ולהשתמש בו תוך שלוש שעות מרגע האיסוף. ראשית, הוסף תמיסת סטוק של calcium M בריכוז 4 mM ב-DMSO לדם בדילול של 1:1000 נפח לנפח. כדי להגיע לריכוז של 4 µM של calcium am, ערבב באמצעות הפיכה עדינה של המבחנה.
בשלב הבא, העבירו 1 mL של דם המסומן בסידן אל עשרה מיקרו-מבחנות בנפח 1.5 mL. הוסיפו לכל מבחנה נוגדן מעכב GP2B3 בדילול הרצוי. הקפידו לכלול ביקורת שלילית ללא נוגדן וביקורת חיובית עם נוגדן לא קשור, וערבבו באמצעות היפוך עדין.
דגרו את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, תוך ערבוב על ידי היפוך עדין מדי 10 דקות לפני ביצוע ניסוי תא הזרימה. יש להגדיר פרוטוקול אוטומטי במודול הבקרה של bio flux עבור קולגן.שלב אחד. הגדירו פרוטוקול להזרמת הדם בקצב של עשרה תשעה סנטימטרים רבוע למשך 10 דקות מהפתח.
כעת יש להגדיר את פרמטרי רכישת הנתונים בתחנת העבודה BioFlex 1000, הכוללים את מיקומי הבמה הרצויים, רכישה באורך גל מתאים והגדרות Time-lapse. תוכנית רכישת תמונות טיפוסית עבור פרוטוקול זה תכלול שדה ראייה אחד לכל ערוץ שיילכד באמצעות עדשה של 10x כל 30 שניות, לאורך משך זמן כולל של 10 דקות. ניתן להגדיר גם שדות ראייה נוספים והגדרות TimeLapse חלופיות.
לאחר שהגדרת את הפרוטוקול האוטומטי ואת פרמטרי רכישת הנתונים, חזור לפלטת ה-BioFlex והסר את הנוזל משני צדי התעלה, למעט מהחורים הפנימיים. תוך הקפדה על עבודה מהירה, הזרק 500 µL דם מכל תנאי ניסוי לבארי המוצא של כל תעלה. שים לב כי בארי המוצא משמשים להגשת הדם מכיוון שזהו המסלול הקצר ביותר לאזור הצפייה, דבר שיאפשר תגובה מיידית יותר של הדם לציפוי הקולגן.
בנוסף, העבירו את דם הביקורת ללא הנוגדן לתעל אחת המצופה בקולגן ולתעל אחת שעברה חסימה בלבד. הניחו את הפלטה על מיקרוסקופ תחנת העבודה BioFlex 1000 והדקו אותה לממשק. בצעו את כיול רשימת הבמה על ידי איתור נקודת הכיול הראשונה, המוגדרת כנקודת הראשית.
לאחר מכן, אתר וסמן את נקודת הכיול השנייה. החל את הכיול הזה על רשימת השלבים המתאימה. פעולה זו מבטיחה שניתן יהיה למצוא באופן אוטומטי את כל מיקומי הצפייה על הפלטה.
הזז את הבמה לאחד הערוצים המכילים דגימות דם, והגדר את פרמטרי לכידת התמונה, כגון זמן חשיפה והגבר (gain), בתוכנת ה-BioFlex montage. הפעל את תזרים העבודה המתאים על ידי לחיצה על הכפתור הרצוי. פעולה זו תפעיל את פרוטוקול הזרימה ואת רכישת התמונות בו-זמנית.
בסיום הניסוי, הוצא את הפלטה מתחנת העבודה BIOFLU 1000 והשלך אותה בהתאם להנחיות המוסדיות. השתמש בתעלות מיקרופלואידיות מצופות קולגן של מערכת ה-bio flux. ניתן להבחין ביצירה נמרצת של קריש דם עם הזמן בדגימת דם של ביקורת לא מטופלת.
לעומת זאת, לא נצפתה התגבשות של קריש בתעלה שאינה מצופה. בניסוי שבוצע לאחרונה, הגודל הממוצע של הצברים בתנאי בקרה היה 2000 micrometer squared. GP IIbIIIa הוא מתווך עוצמתי של אינטראקציות בין טסיות דם ובייצוב אגרגציה כאשר הוא מופעל על ידי היצמדות לקולגן; כפי שמוצג כאן, לאחר אינקובציה עם נוגדן anti-GP IIbIIIa למשך שעה אחת לפני החשיפה למסחור (shear), נצפתה ירידה בגודל הקרישים וכן ירידה בתדירות היווצרותם.
בדרך כלל ניתן להבחין בתגובה תלוית מינון ב-10 dine cm², וערך ה-IC 50 עבור מעכב זה היה 17 nM. העכבה המקסימלית לתורם זה בהשוואה לבקרת ללא נוגדנים הייתה 11% ב-10 dine cm². פלטת 48 בארות למסhear גבוה זמינה גם היא להרצת ניסויי דם מלא עד 200 D per cm² או 5,000 s⁻¹.
הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשתמש בערוצי זרימה מיקרופלואידיים לביצוע ניסויי ביולוגיה וסקולרית רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לדלל את הקולגן בבופר הנכון. השתמשו תמיד בטכניקת פיפטינג נכונה כדי למנוע הכנסת בועות אוויר, ופעלו תמיד בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית של המעבדה שלכם.
זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פורמט של פלטת בארי מיקרופלואידית עבור בדיקות אגרגציה של טבקיות המדמות תנאי זרימה עם גזירה פיזיולוגית. שיטה זו מאפשרת מחקרים בתפוקה גבוהה של היצמדות ואגרגציה של טבקיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של כלי דם
- מיקרופלואידיקה
רקע
- היצמדות טסיות היא קריטית להמוסטזיס ולתרומבוזה.
- בדיקות קונבנציונליות אינן משחזרות תנאי זרימה תחת כוחות גזירה.
- טכנולוגיה מיקרופלואידית מאפשרת בקרה מדויקת על דינמיקת הזרימה.
- מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לכמת אינטראקציות של טסיות.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה מיקרופלואידית המדמה תנאים פיזיולוגיים.
- הערכת ההשפעות של תרכובות תרופתיות על התנהגות טבקיות.
- שיפור היעילות של מחקרי אגרגציה של טבקיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תעלות מיקרופלואידיקה עם ציפוי קולגן.
- שימוש במערכת BioFlux לניסויי זרימה עם מאמץ גזירה מבוקר.
- דימות ברזולוציה גבוהה של היצמדות ואגרגציה של טסיות דם.
- כימות של התוצאות באמצעות רכישת נתונים אוטומטית.
תוצאות עיקריות
- סימולציה מוצלחת של תנאי זרימה עם זריחת גזירה (shear flow) בבדיקות טסיות דם.
- יכולת סריקה בנפח גבוה (high-throughput) עם דרישות מופחתות לנפח דם.
- נתונים כמותיים על אינטראקציות של טסיות דם עם פרמטרים משתנים.
- הדגמה של התאימות של הבדיקה לבדיקת תרופות.
מסקנות
- פורמט פלטת הבארים המיקרופלואידית משפרת מחקרים של אגרגציית טסיות דם.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי התנהגות טסיות דם בתנאים פיזיולוגיים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול פיתוח תרופות ומחקר כלי דם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
בדיקות תאי זרימה מיקרופלואידיות להיצמדות ולתצלבות של טסיות דם מספקות נתונים כמותיים בעלי רלוונטיות פיזיולוגית, הקריטיים למחקר בשלבים מוקדמים של ביולוגיה וסקלרה של כלי דם ותרומבוזה. באמצעות שכפול של תנאי זרימת גזירה, בדיקות אלו מאפשרות הערכה חזויה של תרכובות נוגדות טסיות והפחתת סיכונים מכניסטית בשלב תיקוף המטרה. גישה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת תובנות בעלות תפוקה גבוהה וניתנות לשחזור לגבי תפקוד טסיות תחת תנאים קרובים לפיזיולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מסלולי הפעלת טבקיות תחת זרימה בעלת גזירה מבוקרת.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות אנטי-פלטליות באמצעות מדדי אגרגציה כמותיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות התרכובת על הידבקות לעומת אגרגציה.
- מספק ביטחון ניבוי להקדמת תוכניות בביולוגיה וסקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פורמטים של בדיקות (assays) סטנדרטיים בעתקת תפוקה גבוהה, התואמים לזרימות עבודה של פלטות בארות מסוג SBS.
- מייצר תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סריקת תרכובות וקביעת IC50.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך הערכה פרמקולוגית המשךית.
- מאפשר השוואה אמינה של יעילות מעכבים תחת תנאים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בדיקות תפקוד טסיות במערכת in vitro לתנאי גזירה פיזיולוגיים הרלוונטיים למחלות בבני אדם.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי כימות נקודות קצה של אגרגציה בתנאי זרימה.
- מספק רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לאישור פרה-קליני של סוכנים אנטי-תרומבוטיים.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי מידול תגובות וסקולריות הרלוונטיות למחלה.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
בדיקה מיקרופלואידית זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי המולקולות המובילות (leads) והערכה פרה-קלינית עבור תוכניות למחקר ביולוגיה וסקולרית ואנטי-טבטטית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים של שפעול וצבירה של טבחים.
- סריקה: מציע מוכנות של הבדיקה והשחזור לצורך אפיון כמותי של מעכבים.
- אנליטיקה: מספקת דימוי ברזולוציה גבוהה ומדידות צבירה כמותיות לצורך ניתוח נתונים חסון.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro למודלים וסקסולריים הרלוונטיים למחלה ואסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור ביולוגיה וסקולרית ותהליכי סריקת תרופות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתוכניות המכוונות לטסיות דם.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה ומאפשרת תהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה וניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון באמצעות אספקת נתונים חסונים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסים וסקולריים ואנטי-תרומבוטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, ביולוגיה של כלי דם וניתוח דימויים כמותי.
- דורש גישה לפלטפורמות מיקרופלואידיות אוטומטיות ותשתית מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של הגדרת הבדיקה, רכישת נתונים ופרוטוקולי ניתוח.
- עשוי לדרוש התאמה לחלבוני מטריצה שונים או לתנאי זרימה שונים, בהתאם להקשר המחלה.
- מוגבל על ידי יציבות דגימות הדם ושונות בין תורמים, מה שמחייב תכנון ניסיוני קפדני.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:16
Preparation of the Microfluidic Channels of a BioFlux Plate
4:34
Preparing the Blood with GPIIb/IIIa Inhibitory Antibody
5:41
Running the Flow Cell Experiment on the BF1000 Workstation
8:19
Platelet Adhesion and Aggregation Results
8:58
Conclusion
