שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי
25 בפברואר 2008
קליפתיים זרימת הדם דינמיקה ניתן ללמוד in vivo על ידי הדמיה צבעי ניאון dextran מוזרק לווריד הזנב של מכרסמים עם מיקרוסקופיה 2-פוטון. סרט הווידאו הזה מראה כיצד דם תמונה הדינמיקה לזרום הניאוקורטקס של עכברים באמצעות הכנה זכוכית מכוסה, חלון גולגולתי.
היכולת לדימות של כלי הדם המוחיים ולהקליט את דינמיקת זרימת הדם במוח של מכרסמים חיים היא טכניקה עוצמתית שניתן ליישם במחקר של איסכמיה מוחית או פיזיולוגיה תקינה של המוח. כאן נדגים כיצד להשתמש במיקרוסקופיה פוטונית כפולה לדימות דינמיקת זרימת דם בנאוקורטקס של עכברים חיים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים המוזרקים לווריד הזנב. טכניקה זו פותחה במקור על ידי David Kleinfeld ב-Winfred Dank.
שלום, אני ריקרדו מוטה מהמעבדה של קרלוס פורטר קאיו במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת קליפורניה לוס אנג'לס. בסרטון קודם, הצגנו את השיטה להשתלת חלון גולגולת לצורך ניסויי הדמיה כרוניים in vivo. היום נראה לכם את הפרוצדורה להדמיה של דינמיקת זרימת דם בקליפת המוח דרך חלון גולגולת.
הכנה זו שימושית מאוד מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה בעומק המוח באמצעות מיקרוסקופיית לייזר דו-פוטונית. בואו נתחיל. כדי להדמה את כלי הדם המוחיים, יש להזריק לבעלי החיים צבע פלואורסצנטי בווריד.
אנו משתמשים בצבעים מצומדים לדקסטראן כיוון שמבנה הדקסטראן מונע מהצבע לחצות את מחסום הדם-מוח ולהדלוף מכלי הדם. העכברים הרדימים מושפעים מ-isof fluorine, 4% לאינדוקציה ו-1.5 עד 2% במהלך ההזרקה. לאחר מכן, הזנב מחטא באמצעות שלושה שפשופים של 70% alcohol; באמצעות מחט בקוטר 26 gauge, מזריקים דרך וריד הזנב 75 עד 100 µL של תמיסה 5% של R domine Dextran המומס בסליין.
ניתן לצלם את בעלי החיים במיקום אמצעי לאורך גב הזנב מיד לאחר הזרקה לווריד הזנב, ועד להפרשת הצבע בשתן, שיהפוך לוורוד בשימוש בצבע ERO domine. כעתיים לאחר ההזרקה של צבע פלואורסצנטי Dexter, העכבר מורדם באמצעות isof fluorine. שוב, 4% להשראה, ו-1 עד 1.5% להדמיה. העכבר מחובר בחוזקה לשולחן המיקרוסקופ באמצעות מוט טיטניום, הכולל פלטת חימום מווסתת טרמית לשמירה על חום גוף בעל החיים.
מרחיקים מעט משחה לעיניים כדי לשמור על לחות העיניים. זכוכית הכיסוי של החלון הגולגולתי מנוקה עם 70% alcohol. החלון ממוקם במקביל למישור המוקד וממורכז בשדה הראייה.
תחת עדשה בעלת הגדלה של פי 4, מומלץ לצלם את כלי הדם על פני השטח של המוח באמצעות מצלמה דיגיטלית. תמונה זו תשמש כתמונת ייחוס במפגשי הדמיה עוקבים, כדי לאתר את אותו אזור בדיוק מדי יום. לאחר מכן, מחליפים את העדשה בעלת ההגדלה של פי 4 בעדשת טבילה במים בעלת הגדלה של פי 40.
ללא הזזת הבמה, נלקחת תמונה דיגיטלית של השטח. שוב, קואורדינטות המניפולטור של הבמה מאופסות. אנו משתמשים בתוכנת scan image עבור רכישת התמונה.
תוכנה זו נכתבה ב-MATLAB על ידי טום פול רודו וברנרדו סבטיני במעבדה של קרלס ווטו. לאחר מכן נדליק את שאר הציוד: הלייזר, מד העוצמה, שפופרות מכפיל הפוטונים, המגברים וכן הלאה. נסרוק בקצרה בהגדלה נמוכה את שטח החלון המתאים לדימוי כדי למצוא את האזורים הטובים ביותר.
ברגע שאלו זוהו, מצולם סדרק (stack) בהגדלה נמוכה של האזור הנבחר לדימות, וקואורדינאטות ה-XY שלו מסומנות כדי לתעד את דינמיקת זרימת הדם בכלי דם קטנים או בנימיות. אנו משתמשים בסריקות קו (line scans) לאורך של 40 microns לפחות של כלי הדם הרלוונטי. סריקות בודדות אלו, הנמשכות שנייה אחת, מבוצעות תוך שימוש בהספק לייזר נמוך ככל האפשר, והקואורדינאטות וזווית הסריקה נרשמות.
עם סיום סשן הדימות, בעל החיים מועבר לתא חימום שבו הוא יכול להתאושש מההרדמה. כאן אנו מציגים ערימה של מאה תמונות שצולמו בכל חמישה מיקרונים באמצעות מיקרוסקופ הפוטונים הכפולים שלנו, דרך חלון קרניאלי שהוצב מעל קליפת המוח הסומטוסנסורית של עכבר בן חמישה חודשים שהוזרק לו r Domine dextran דרך וריד הזנב. רצף תמונות זה מראה את הרשת המורכבת של כלי דם גדולים וקטנים, כולל נימים.
הצגנו כעת שיטה לוויזואליזציה של דינמיקת זרימת דם in vivo באמצעות חלון קרניאלי. זוהי שיטה עוצמתית ביותר לדימות דינמיקת זרימת דם מוחית בכלי הדם הקורטיקליים, למשל, כדי לחקור שינויים בזרימת הדם לאחר שבץ. ניתן לבצע מספר דימויים בנקודות זמן שונות ב-BULs באמצעות הזרקות חוזרות של הצבע הפלואורסצנטי לווריד הזנב.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בתנאים הנקיים והסטריליים ביותר האפשריים ולהחזיק יד יציבה מאוד. אוקיי, וזה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את הטכניקה של דימוי דינמיקת זרימת דם בנאוקורטקס של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית. צבעי דקסטראן פלואורסצנטיים מוזרקים לווריד הזנב, מה שמאפשר תצפית in vivo של כלי הדם המוחים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- דימות כלי דם
- טכניקות In Vivo
רקע
- דימוי של זרימת הדם המוחית חיוני להבנת פיזיולוגיית המוח.
- ניתן להחיל טכניקה זו על מחקרים של איסכמיה מוחית.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית מאפשרת דימוי מפורט של דינמיקת זרימת הדם.
- צבעים פלואורסצנטיים מספקים ניגודיות להדמיית כלי דם.
מטרת המחקר
- להדגמת דימות של דינמיקת זרימת דם בנאוקורטקס.
- להצגת השימוש בחלון קרניאלי לדימות כרוני.
- לספק מדריך ויזואלי לחוקרים המעוניינים בטכניקה זו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת צבעי דקסטראן פלואורסצנטיים לווריד הזנב של עכברים.
- שימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית לצורך דימות.
- הכנת חלון גולגולתי מכוסה בזכוכית לצורך גישה לנאוקורטקס.
- דימות in vivo של דינמיקת זרימת הדם במכרסמים חיים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של דינמיקת זרימת הדם בנאוקורטקס (neocortex).
- הדגמה של יעילות הכנת החלון הגולגולתי.
- הדגמה של יישום צבעים פלואורסצנטיים בדימות.
- תובנות לגבי כלי הדם המוחיים וויסות זרימת הדם.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת תובנות בעלות ערך לגבי פיזיולוגיה של המוח.
- ניתן ליישמה במחקרים שונים העוסקים בזרימת דם מוחית.
- השיטה משפרת את הבנתנו לגבי איסכמיה מוחית ומצבים קשורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי 2-פוטון in vivo של זרימת דם בנאוקורטקס באמצעות חלון גולגולתי מאפשר הערכה כמותית ברזולוציה גבוהה של דינמיקה מיקרו-וסקולרית מוחית במכרסמים חיים. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים מכניסטיים ולתיקוף מטרות בקווי מחקר של מחלות נוירו-וסקולריות ומחלות ניווניות של מערכת העצבים. השיטה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובנקודות מפנה פרה-קליניות, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי פורטפוליו של טיפולים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של תגובות כלי דם להפרעות ניסיוניות באזורי מוח רלוונטיים למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרה באמצעות כימות שינויים בזרימת הדם בתגובה להתערבויות מועמדות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי קישור בין מטרות מולקולריות לתוצאות כלי דם פיזיולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק מערכת in vivo מתוקפת למדידה כמותית של דינמיקת זרימת דם.
- מאפשר הדמיה הדירה של אותו אזור קורטיקלי לאורך מספר מפגשים לצורך מחקרים אורך.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות מתן צבע מבוקר ופרוטוקולי הדמיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתן אפשרות למדידת תפקוד כלי דם במודלים של שבץ מוחי, ניוון עצבי וגידולי מוח.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות אספקת נקודות קצה כמותיות הרלוונטיות למחלות בבני אדם.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מתן מדדים (readouts) חסונים ובעלי רלוונטיות פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מהווה גשר בין זיהוי מטרה מולקולרית לבין תיקוף תפקודי במערכות חיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על מנגנונים נוירו-וסקולריים ומעורבות של מטרות ביולוגיות.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של זרימת דם לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של פרמטרי זרימת דם בין קבוצות ניסוי ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מספקת נקודות קצה התואמות לסממנים ביולוגיים של דימות קליני של פרפוזיה מוחית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה רב-שימושית למחקרי כלי דם מגוונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) על פני תוכניות טיפוליות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר נוירו-וסקולרי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה של דימות in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go באמצעות נתונים כמותיים בעלי רלוונטיות פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים לטיפולים ב-CNS המותאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בבעלי חיים קטנים, בדימות in vivo ובניתוח כמותי.
- דורש גישה למיקרוסקופיה דו-פוטונית, תוכנה לרכישת תמונות ותשתית תמיכה בבעלי חיים.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית בין הצוותים להכנת הצבע, להזרקה ולפרוטוקולי דימות.
- התאמה למודלים אחרים של מכרסמים או לאזורי מוח אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- עומק הדימות והקינטיקה של פינוי הצבע עשויים להגביל את הישימות עבור תכנוני ניסוי מסוימים.
