Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Questa procedura inizia rimuovendo eventuali detriti dall'influenza. Una soluzione virale mediante centrifugazione. La membrana virale viene quindi frammentata con il detergente e i VR nps rilasciati vengono separati su un gradiente di glicerolo.

Le frazioni ottenute dalla centrifugazione in gradiente vengono raccolte ed è eseguita un'aliquote di ciascuna frazione. Su una gel SDS-PAGE, i gel vengono colorati con blu di Coomassie per determinare le frazioni di picco contenenti le V NPS; le frazioni contenenti le V NPS vengono quindi concentrate mediante centrifugazione e le VRP purificate vengono applicate su una griglia per microscopia elettronica a trasmissione (TEM) in rame, che viene successivamente colorata negativamente per la visualizzazione delle VRP mediante microscopia elettronica a trasmissione. Ciao, sono WinCo Wu nel laboratorio della dottoressa Nellie Pane del Dipartimento di Zoologia dell'Università della British Columbia.

Sono Lindsay Weaver, precedentemente del Laboratorio Pane. Oggi vi mostreremo un procedimento per la purificazione di complessi proteici ribonucleici virali dell'influenza. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'importazione nucleare del virus dell'influenza A in cellule di coltura tessutale.

Cominciamo. Per iniziare l'esperimento, aggiungere 750 microlitri di tampone MNT in un tubo Beckman in policarbonato da 11 millimetri per 34 millimetri. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di una soluzione di virus dell'influenza A a 2 milligrammi per millilitro nel tubo e pipettare su e giù diverse volte per mescolare il virus con il tampone MNT.

Dopo aver mescolato, posizionare il tubo in un rotore TLA 100.2 e centrifugare in una centrifuga Beckman Optima max E per 10 minuti a 109.000 × g a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante, quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer di rottura e vorticare vigorosamente. Successivamente, agitare a 31 gradi Celsius per 20 minuti in un termomixer Einor.

Al termine dell'agitazione, procedere con la centrifugazione per velocità di sedimentazione su gradiente di glicerolo. Per preparare il gradiente di glicerolo, aggiungere le seguenti quantità di glicerolo in un tubo da centrifuga Beckman UltraClear di 13 millimetri per 51 millimetri: un millilitro di glicerolo al 70% volume/volume, 0,75 millilitri di glicerolo al 50%, 0,375 millilitri di glicerolo al 40% e 1,8 millilitri di glicerolo al 33%. Queste soluzioni di glicerolo vengono preparate mescolando glicerolo puro con tampone NM.

Preparare anche un tubo di bilanciamento contenente sia glicerolo che tampone. Successivamente, vortexare nuovamente il campione virale lisato e caricarlo sul gradiente di glicerolo. Posizionare il tubo in un rotore a cestello oscillante Beckman MLS 50 e centrifugare il gradiente per tre ore e 45 minuti a 217.000 ×g a quattro gradi Celsius.

Al termine della centrifugazione, raccogliere manualmente aliquote da 250 microlitri del gradiente a partire dalla parte superiore del tubo. Mantenere le frazioni sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Dopo aver raccolto le frazioni, si è pronti per analizzarle mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS.

Per iniziare l'analisi SDS-PAGE, prelevare 20 microlitri da ciascuna frazione e trasferirli in una provetta pulita. Aggiungere quindi 5 microlitri di buffer campione SDS-PAGE 5X e riscaldare il campione a 95 gradi Celsius per 5 minuti. Dopo il riscaldamento, centrifugare brevemente i campioni e caricarli su un gel di poliacrilamide al 10%, inserendo marcatori del peso molecolare in una delle pozzetti. Successivamente, far migrare i campioni attraverso il gel fino a quando il colorante di carico bromofenolo blu non raggiunge una posizione prossima al fondo del gel.

Rimuovere il gel dall'apparecchio SDS-PAGE e colorare il gel con blu di kumasi. Sulla base dei risultati della colorazione, identificare le frazioni che contengono principalmente la nucleoproteina dell'influenza.

La NP dell'influenza A ha una dimensione di circa 56 chilodalton ed è la principale proteina presente nei complessi ribonucleoproteici virali. Pertanto, la banda della NP è generalmente la banda più intensa nelle frazioni contenenti i VRNP. Nella prossima parte, concentreremo queste frazioni di VRNP.

Combinare le frazioni di glicerolo contenenti principalmente NP e distribuirle in due provette Beckman in policarbonato da 11 millimetri per 34 millimetri; riempire ogni provetta con etilpirocarbonato o acqua ultrapura trattata con DEPC. Quindi pipettare su e giù diverse volte per mescolare. Posizionare le provette in un rotore Beckman TLA 120.2 e centrifugare per quattro ore e mezza a 157.000 ×g a quattro gradi Celsius.

Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet. In un'aliquote di 50 microlitri di acqua trattata con DEPC, aliquotare l'NPS V purificato, mettere da parte un'aliquote e conservare le altre a meno 80 gradi Celsius. Ora siamo pronti per procedere con la colorazione negativa dei VRP.

Diluire un microlitro di VRNP purificato in nove microlitri di tampone PBS appena preparato e filtrato due volte. Sottoporre a scarica al plasma una griglia di osservazione al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) in rame per 30 secondi. Tale griglia era stata precedentemente ricoperta con un film di Parlow Dion e carbonio. Utilizzando pinzette per tenere la griglia appena sottoposta a scarica al plasma, applicare sulla griglia un'abbondanza di cinque microlitri di VRNP diluito.

Lasciare assorbire la goccia sulla griglia per otto minuti durante l'attesa. Posizionare una piccola striscia di parfum in un vassoio, quindi dispensare sul parfum due gocce contenenti ciascuna 10 microlitri di tampone PBS, nonché una goccia da 80 microlitri della soluzione di colorazione appena preparata, composta da 1% ammonium molybdate. Lavare ora la griglia del campione abbassandola con cura nelle due gocce di PBS per un tempo totale di un minuto.

Quindi, utilizzare un pezzo di carta da filtro per asportare parte della soluzione campione dalla griglia del campione, senza permettere che la griglia si asciughi. Immediatamente dopo aver asportato l'ultima goccia di tampone dalla griglia del campione, immergere completamente la griglia all'interno della goccia di colorante. Attendere un minuto.

Dopo un minuto, utilizzare un nuovo pezzo di carta da filtro per rimuovere completamente la soluzione di colorante dalla griglia del campione. Lasciare asciugare all'aria la griglia del campione per alcuni minuti prima dell'osservazione. Al microscopio elettronico a trasmissione, queste sono immagini rappresentative di microscopia elettronica a trasmissione di V nps colorati negativamente.

Come si può osservare qui, le V NPS assomigliano a particelle a forma di bastoncello con lunghezza variabile che misurano approssimativamente da 30 a 120 nanometri. L'NP oligomerico è organizzato come una catena di molecole di NP che si ripiega ulteriormente in una struttura ripetuta a doppia elica. Pertanto, a volte possono essere visibili dei loop alle estremità di queste particelle a forma di bastoncello.

Abbiamo appena mostrato come purificare e visualizzare l'influenza. Complessi ribonucleoproteici virali. Quando si esegue questa procedura, è importante non utilizzare PBS per diluire i VR mps se si usa l'acetato di uranile per la colorazione negativa.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.