Identificazione dei fenotipi inibizione della crescita indotta da Espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito

Per iniziare questo protocollo, selezionare un vettore per l'espressione del tuo effettore batterico preferito. Nel lievito e nella ceppo di lievito, il vettore viene quindi trasformato nelle cellule di lievito. Successivamente, l'espressione dell'effettore viene indotta.

Le cellule indotte vengono lisate per l'analisi successiva mediante western blot al fine di verificare l'espressione dell'effettore. Dopo aver confermato l'espressione dell'effettore, le cellule vengono coltivate e diluite in serie di dieci volte, quindi piastrate su mezzi repressivi e induttivi. Infine, dopo due o tre giorni, viene analizzata la crescita del lievito.

Ciao, sono Do Solomon del laboratorio del Dottor Guido Cesa presso il Dipartimento di Scienze Vegetali dell'Università di Tel Aviv. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'identificazione di fenotipi di inibizione della crescita indotti dall'espressione di effettori di tipo tre batterici nel lievito. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la funzione degli effettori di tipo tre provenienti da batteri patogeni Gram-negativi ed è uno strumento che ci aiuta nell'identificazione delle proteine bersaglio TIC degli effettori.

Iniziamo. Diversi fattori importanti devono essere considerati e ottimizzati durante la progettazione di un sistema di lievito adatto all'espressione degli effettori di tipo tre di interesse. Il primo è il promotore che guida l'espressione degli effettori.

Poiché i fattori effettori di tipo tre batterici possono essere tossici per le cellule di lievito, è consigliabile utilizzare un promotore inducibile per controllarne l'espressione. In questo esperimento utilizzeremo il promotore GAL1. Il secondo fattore è il numero di copie del gene effettore.

Si ottengono livelli di espressione elevati quando il gene effettore è portato da un plasmide di due micron. Un'espressione intermedia si ottiene utilizzando un plasmide contenente un centromero, mentre un'espressione bassa si ottiene quando il gene effettore viene integrato nel genoma del lievito mediante ricombinazione omologa. Un terzo fattore da considerare è il tag epitopo utilizzato per verificare l'espressione proteica nei casi in cui non sono disponibili anticorpi contro l'effettore di interesse.

I marcatori comunemente utilizzati sono l'emagglutinina M HA o il marcatore flag, per i quali sono disponibili anticorpi commerciali affidabili. Si consiglia di utilizzare un solo copy del marcatore per minimizzare effetti indesiderati e dannosi sulla struttura e sull'attività della proteina effettrice. Ultimo ma non meno importante, il ceppo di lievito da utilizzare per l'espressione deve essere tropico per il marcatore selezionabile del vettore di espressione.

Per coltivare cellule di lievito per la trasformazione, prelevare una colonia di lievito da una piastra fresca e inoculare tre millilitri di YPD in un tubo polipropilenico da 15 millilitri. Vortexare brevemente il tubo di coltura, quindi posizionarlo su un roller e incubare tutta la notte a 30 gradi Celsius con rotazione costante. La mattina seguente, rimuovere la coltura dal roller e centrifugare a 800 G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, rimuovere completamente il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di tampone di risospensione Resus, mescolando mediante vortex alla velocità massima per circa 10 secondi. Per ogni plasmide da trasformare e per una trasformazione di controllo aggiuntiva, trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in una provetta microcentrifuga. Aggiungere a ciascuna provetta, tranne che alla provetta di controllo, cinque microlitri di DNA di sperma di salmone a filamento singolo e da 250 a 500 nanogrammi di DNA plasmidico.

Successivamente, aggiungere con attenzione 650 microlitri di soluzione di trasformazione in ogni provetta e vortexare. Incubare le provette a 30 gradi Celsius per 30 minuti su un agitatore rotante. Al termine dell'incubazione, aggiungere 70 microlitri di DMSO in ogni provetta e mescolare capovolgendo le provette da 10 a 15 volte per evitare di rompere le cellule.

Non vortexare le provette. Posizionare le provette in un bagno d'acqua preriscaldato a 42 gradi Celsius e incubare per 15 minuti. Trascorsi 15 minuti, rimuovere le provette dal bagno d'acqua e posizionarle immediatamente sul ghiaccio per due minuti.

Dopo che i tubi si sono raffreddati, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, quindi utilizzare una pipetta per rimuovere con attenzione il sopranatante viscoso. Ripesare ogni pellet in 150 microlitri di acqua distillata sterile e distribuire la sospensione cellulare su una piastra contenente il mezzo selettivo appropriato. Lasciare le piastre aperte per due minuti e farle asciugare in un armadio a flusso laminare.

In seguito, posizionare le piastre in un incubatore a 30 gradi Celsius per due o tre giorni per far crescere le cellule di lievito. Per preparare un estratto proteico, inoculare tre millilitri del mezzo di repressione appropriato con una colonia di lievito proveniente da una piastra fresca e vortexare. Il giorno seguente, posizionare brevemente il tubo di coltura su un rullo a 30 gradi Celsius.

Rimuovere la coltura dal roller e centrifugare a 800 G per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare. In tre millilitri di acqua distillata sterile mescolata mediante vortex, centrifugare nuovamente, scartare il soprannatante e risospendere le cellule in tre millilitri di acqua distillata sterile. Trasferire ora 200 microlitri della sospensione cellulare in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri del mezzo induttore appropriato mescolato mediante vortex.

Posizionare il tubo su un rullo e incubare tutta la notte a 30 gradi Celsius; il mattino seguente trasferire un millilitro della coltura, oppure di più per colture a bassa densità, in un tubo da microcentrifuga. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 800 G per cinque minuti a temperatura ambiente; da questo punto in poi lavorare in cappa a flusso laminare per evitare l'inalazione di vapori tossici di etanolo Beamer capto.

Rimuovere con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione di lisi fredda. Mescolare vigorosamente mediante vortex e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Durante l'incubazione di 30 minuti, determinare il volume di acido cloridrico normale 6 necessario per titolare 100 microlitri di tampone di lisi fino a pH 9-10.

Per fare ciò, aggiungere diversi volumi di acido cloridrico a 100 microlitri di buffer di lisi in 10 tubi diversi e verificare il pH della soluzione utilizzando una striscia indicatrice di pH al termine dell'incubazione, aggiungendo il volume appropriato di acido cloridrico al lisato e mescolando mediante vortex. Quindi aggiungere 50 microlitri di buffer campione 3x al lisato e mescolare mediante vortex. Praticare un foro nel coperchio del tubo da microcentrifuga con un ago e far bollire la soluzione di lisato su un blocco riscaldante per cinque minuti. Dopo l'ebollizione, lasciare raffreddare la soluzione per due minuti a temperatura ambiente.

Quindi vortexare la soluzione del lisato e centrifugarla per 10 secondi. Il lisato è ora pronto per l'analisi immunologica del sangue per preparare le cellule per il saggio di spotting. Coltivare colture da tre millilitri di ciascun ceppo come mostrato in precedenza il giorno seguente.

Preparare due piastre contenenti mezzo sintetico completo privo di leucina. Il mezzo di una piastra deve essere integrato con il 2% di glucosio e quello dell'altra piastra con il 2% di galattosio e l'1% di raffinosio. Asciugare le piastre in un'area di flusso laminare sterile a temperatura ambiente per 20 minuti.

Raccogliere le cellule e risospendere ogni pellet cellulare in tre millilitri di acqua distillata sterile. Ripetere la centrifugazione e risospendere nuovamente le cellule in tre millilitri di acqua distillata sterile. Determinare la densità ottica o OD di ciascuna coltura, quindi preparare sospensioni cellulari di un millilitro con un OD 600 pari a uno in provette microfiche sterili.

Successivamente, preparare tre diluizioni seriali di ordine dieci da ciascuna delle sospensioni cellulari utilizzando tre microprovette sterili contenenti 900 microlitri di acqua distillata sterile (DDW). Posizionare le piastre asciutte su una griglia e, per ciascun punto di inoculo, depositare 10 microlitri delle quattro diluizioni in sequenza. Dopo l'inoculo, lasciare le piastre aperte nell'abbattitore per alcuni minuti.

Quando le macchie sono asciutte, coprire le piastre e collocarle in un incubatore a 30 °C per due o tre giorni. Ora mostreremo i risultati di un saggio di spotting su lievito per la rilevazione dell'inibizione della crescita. Fenotipi indotti dall'espressione di effettori di tipo tre, in questo caso gli effettori di tipo tre A-V-R-P-T-O hop, AA one one e AAV RE one del batterio.

Il percorso di Pseudomona Riner del nostro pomodoro è stato espresso da un plasmide contenente un centromero in una ceppa di lievito su mezzo repressivo. Le ceppi di lievito portatrici del plasmide per l'espressione di A-V-R-P-T-O e HOP AA one one hanno mostrato una crescita simile a quella della ceppa controllo contenente un vettore vuoto. Mentre il lievito portatore di AAV RE one ha mostrato una crescita leggermente ridotta, probabilmente a causa della perdita del promotore GAL one e dell'elevata citotossicità di AV RE one, nelle condizioni induttive l'espressione di AV E one o di HOP AA one one ha causato un fenotipo di inibizione della crescita drastica, riflesso dall'assenza di colonie in ogni diluizione. Al contrario, l'espressione di A-V-R-P-T-O non ha esercitato alcun effetto inibitorio sulla crescita.

È stato appena mostrato come identificare fenotipi di inibizione della crescita causati dall'espressione di effettori batterici di tipo tre nel lievito. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di scegliere con attenzione sia il vettore di espressione che il ceppo, poiché entrambi possono influenzare notevolmente i risultati. Inoltre, ricordarsi di utilizzare colonie appena trasformate in tutti i passaggi della procedura.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.