Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il destino della zona di Repli e della RNA polimerasi o RNAP in seguito a una collisione frontale. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando il complesso di trascrizione su DNA biotinilato e immobilizzandolo su tablet e perle Stripp, il che porterà alla formazione di un complesso allungato di RNAP arrestato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel legare un DNA forcellato preformato al complesso allungato di RNAP per formare una forcella di replicazione a valle della RNAP in collisione frontale.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'assemblare la zona di riplica e avviare la sintesi del filamento guida alla forcella di replicazione. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'isolare il DNA dalle perle magnetiche e purificare il DNA su una colonna di ripulitura PCR. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'arresto del roso in seguito alla collisione con il complesso di trascrizione head-on, mediante un gel agarosio alcalino dei prodotti di DNA radioetichettati purificati.

Ciao, sono Richard Pomerance del laboratorio di Mike O'Donnell presso la Rockefeller University. Oggi vi mostrerò il procedimento per effettuare una collisione tra un ribosoma e una RNA polimerasi in fase solida. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare come il processo di replicazione sia influenzato dai complessi di trascrizione lungo il DNA.

Iniziamo. Per iniziare questo protocollo, mescolare l'enzima RNA polimerasi oloenzima con un template di DNA biotinilato di 3,6 KB contenente il promotore T7A1 in 100 microlitri di buffer A; incubare la miscela per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione di 10 minuti, aggiungere i ribonucleotidi adenosina trifosfato, citidina monofosfato e uridina adenilica, che limiteranno la sintesi dell'RNA a 20 nucleotidi.

Incubare la soluzione per ulteriori 10 minuti a 37 gradi Celsius per immobilizzare il complesso di allungamento dell'RN ape arrestato sulle perle. Aggiungere la soluzione a perle magnetiche rivestite con streptavidina. Lasciare incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente.

Purificare il complesso di allungamento dell'RNAP immobilizzato e arrestato lavando le perle con 0,9 millilitri di tampone ad alto contenuto salino. Per rimuovere i complessi R-N-A-P-D-N-A non specifici dopo ogni lavaggio, rimuovere il sopranatante mediante separazione magnetica. Questo lavaggio deve essere ripetuto cinque volte.

Quindi, le perle devono essere lavate altre due volte con 0,9 millilitri di buffer A. Dopo l'ultimo lavaggio, il forcone di replicazione a valle può essere assemblato per formare un forcone di replicazione a valle del complesso RNAP in avanzamento frontale; sospendere la striscia magnetica con le perle associate al complesso di elongazione RNAP arrestato in 100 microlitri di buffer quattro di New England Biolabs. Successivamente, aggiungere 10 unità di fosfatasi alcalina di gambero (SAP) e incubare il campione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le perle tre volte con 0,9 millilitri di buffer A. Quindi, risospendere le perle in 50 microlitri di buffer per reazione di ligasi T4 rapida.

Aggiungere due microlitri di ligasi T4 rapida e DNA forcellato preformato, incubare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare le perle altre tre volte con 0,9 millilitri di tampone A, quindi aggiungere esamero e DNA elicasi al complesso di allungamento dell'RNAP arrestato e alla forca di replicazione a valle, legati alle perle di streptavidina magnetica. Preparare la soluzione in 150 microlitri di tampone A e incubarla per 30 secondi a 23 gradi Celsius.

Dopo una breve incubazione di 32 secondi a 23 gradi Celsius. Alla polimerasi tre beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcato dGTP e alfa P 32 marcato dATP fino a un volume di 200 microlitri. Incubare il campione per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Avviare la replicazione aggiungendo la proteina legante il DNA a filamento singolo, DCTP e DTTP. Aggiungere inoltre DTTP e DCTP marcati con P 32-alfa, portando il volume finale a 250 microlitri. Dopo 10 minuti, arrestare le reazioni aggiungendo 12 microlitri di EDTA 0,5 M.

Successivamente, far bollire le perline din per rilasciare il DNA dalle perline. Rimuovere qualsiasi residuo di DNA trattando le perline con proteinasi K per 30 minuti a 50 gradi Celsius. Far bollire nuovamente le perline e rimuovere il soprannatante mediante separazione magnetica.

Purificare il surnatante combinato contenente il DNA utilizzando il kit di purificazione PCR Kyogen. Infine, analizzare i prodotti di DNA marcati radioattivamente purificati in un gel alcalino aros. La collisione della zona con una RNAP frontale produce solitamente due prodotti di lunghezza pari a 2,5 KB e 3,6 KB. Il prodotto di 2,5 KB rappresenta la lunghezza del DNA dalla forcella fino alla RNAP arrestata.

Ciò è dovuto all'arresto della replicazione in seguito alla collisione con la RNAP. Il prodotto di 3,6 KB rappresenta il DNA di lunghezza intera ed è il risultato di un'occupazione incompleta del promotore da parte della RNAP o di un parziale superamento della replicazione in senso opposto alla RNAP. Un buon risultato dimostra che viene prodotto circa il 50% di DNA di lunghezza intera.

Tuttavia, in alcuni casi si verifica una minore occupazione del promotore da parte della RNAP e si osserva una percentuale maggiore di DNA di lunghezza completa. Questo accade perché una popolazione maggiore di zone di replicazione non incontra una RNAP in collisione frontalmente; in assenza di una RNAP arrestata, si ottiene esclusivamente DNA di lunghezza completa. Abbiamo appena mostrato come eseguire la replicazione in fase solida in presenza di un complesso di allungamento della RNA polimerasi arrestato legato al DNA. Durante questa procedura, è importante lavare il complesso di trascrizione arrestato con una soluzione ad alta forza ionica per rimuovere l'eccesso di RNA polimerasi, che si lega in modo non specifico al DNA e inibisce la replicazione.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.