Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la conservazione evolutiva della proteina da shock termico G 96 nel promuovere risposte delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene nella rana Xenopus laevis. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo i leucociti peritoneali mediante lavaggio peritoneale. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trattare i leucociti peritoneali con GP 96 derivata da tumore, che accompagna antigeni minori e tumorali, dopo incubazione e lavaggi.

I leucociti peritoneali vengono trasferiti in modo adottivo mediante iniezione intraperitoneale in rane naive al fine di sensibilizzare queste rane nei confronti di antigeni tumorali o di istocompatibilità minore. Il terzo passaggio della procedura consiste nel trapiantare un lembo di cute o nel sottoporre le rane sensibilizzate a una sfida tumorale, monitorando l'insorgenza del rigetto del trapianto di cute o la comparsa del tumore. L'ultimo passaggio della procedura prevede il prelievo di sangue periferico per caratterizzare le cellule T coinvolte nelle risposte di rigetto cutaneo e antitumorali.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un significativo acceleramento del rigetto del trapianto cutaneo, nonché ritardi nell'insorgenza del tumore in rane sensibilizzate alla GP 96, rispettivamente tramite i saggi di trapianto cutaneo e di sfida tumorale. Ciao, sono Christina Koska nel laboratorio del Dott. Jacque Robert del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia presso il University of Rochester Medical Center. Sono anche Tanya Cruz, del laboratorio del Dott. River.

Oggi vi mostreremo un procedimento per sensibilizzare rane clonate mediante trasferimento adottivo di leucociti peritoneali, seguito da trapianto di innesti cutanei e saggi di trapianto tumorale. Inoltre, vi mostreremo anche come prelevare sangue periferico da questi animali. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la capacità della proteina da calore GP96 di promuovere cellule CDAT specifiche per l'antigene in Salla, nonché per analizzare i tipi cellulari coinvolti.

Ok, iniziamo. Le rane utilizzate nei nostri esperimenti sono cloni genetici ISO provenienti dalla nostra colonia di allevamento presso l'Università di Rochester. Per indurre i leucociti peritoneali, o PL, da raccogliere, utilizzare un ago da 25 gauge cinque ottavi per iniettare per via intraperitoneale nella rana anestetizzata una preparazione di e. coli uccisa termicamente. Tre giorni dopo l'iniezione, i PL vengono raccolti mediante lavaggio intraperitoneale.

Per iniziare questa procedura, disinfettare l'addome della rana anestetizzata con una piccola quantità di etanolo al 70%. Quindi utilizzare un ago da 18 gauge lungo 1,5 pollici per iniettare cinque millilitri di soluzione salina fosfato sterile tampone per anfibi, o PBS preriscaldata a temperatura ambiente, nella cavità peritoneale. Rimuovere l'ago e massaggiare delicatamente la rana per un minuto per assicurare che il tampone iniettato si mescoli uniformemente con il liquido presente nella cavità corporea.

Successivamente, inserire un nuovo ago da 18 gauge lungo 1,5 senza siringa nell'addome della rana. Evitando i vasi sanguigni, raccogliere il liquido peritoneale che gocciola dalla parte posteriore dell'ago in un tubo conico pulito da 50 millilitri. Assicurarsi di recuperare la maggior quantità possibile del volume iniziale iniettato dopo che i PL sono stati raccolti.

Mettere la rana in un contenitore con acqua poco profonda fino a quando non si sveglia, momento in cui può essere rimessa nella sua gabbia. Una volta raccolti i pls, centrifugare a 1000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il sopranatante e risospendere i pls in PBS A freddo.

Trasferire il PLS RISOSPESO in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per impulsi di PLS con GP 96, aggiungere la quantità appropriata di GP 96 al PLS e mescolare mediante pipettaggio; incubare sul ghiaccio per un'ora dopo un'ora.

Centrifugare le cellule a 14.000 giri al minuto per un minuto. Per rimuovere qualsiasi GP 96 non legata, eliminare il soprannatante. Aggiungere PBS A freddo e risospendere.

Sospendere nuovamente il PLS in centrifuga. Lavare il S con A-P-B-S-A freddo per un totale di tre volte per assicurarsi che non rimanga traccia di G 96 dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere il PLS pulsato a una concentrazione di cinque volte 10 alla cinque PLS per 300 microlitri di PBS per trasferire in modo adottivo i PLS in sei recettori naive LG.

Iniettare per via intraperitoneale 300 microlitri di pls attivato per animale. Le rane devono essere sensibilizzate almeno tre giorni prima degli esperimenti di innesto cutaneo o di sfida con tumori, che verranno mostrati successivamente. La pelle per l'innesto viene prelevata da una rana donatrice LG 15 anestetizzata.

Utilizzare le forbici per tagliare e rimuovere un piccolo pezzo di pelle ventrale, ovvero la pelle addominale che appare argentata. A causa della presenza di quattro cellule pigmentate ARI durante la manipolazione dell'innesto, è fondamentale ridurre al minimo la manipolazione del tessuto, poiché ciò potrebbe causare danni all'innesto.

Tenere delicatamente la pelle con la pinzetta e posizionarla in una piastra di Petri contenente PBS A freddo. Mantenere la piastra di Petri in posizione. Posizionare la pelle su un vetrino pulito e utilizzare un rasoio per tagliare innesti singoli in pezzi di cinque millimetri per cinque millimetri.

Mantenere i frammenti in PBS su ghiaccio per innestare la pelle su sei rane riceventi. Innanzitutto, praticare una piccola incisione sulla pelle dorsale della rana ricevente anestetizzata. Successivamente, inserire l'innesto di cinque millimetri per cinque millimetri sotto la pelle con il lato argentato rivolto verso l'alto.

Assicurarsi di notare i segni di forbici e pinzette sui trapianti, poiché questi non vengono considerati rigetto del trapianto. Una volta iniziato il punteggio dopo 24 ore, è necessario rimuovere una parte della pelle dell'ospite sovrastante dal trapianto. Utilizzare le forbici per ritagliare una finestra intorno al trapianto in modo che quest'ultimo possa essere visualizzato liberamente.

Attenzione a non toccare la pelle del donatore né a provocare sanguinamento. Iniziare immediatamente a eseguire il punteggio dell'innesto effettuando un disegno. Innesto cutaneo.

Il rigetto è determinato dalla percentuale di distruzione dell'aridolo sulla cute innestata. L'innesto deve essere controllato ogni due o tre giorni al microscopio stereoscopico. Preparare le cellule tumorali per il trapianto mediante risospensione in mezzo di coltura tumorale a una densità di cinque volte 10 alla cinque cellule per 300 microlitri.

Trapiantare le cellule mediante iniezione sottocutanea su un lato della parte dorsale dell'animale. Vengono iniettate cinque volte 10 alla cinque cellule in un volume di 300 microlitri per ogni rana. La crescita del tumore inizierà entro due o tre settimane dal trapianto del tumore.

Osservare l'aspetto iniziale del tumore. Utilizzare un calibro per misurare le dimensioni del tumore e registrarne il volume ogni due o tre giorni prima del prelievo di leucociti sanguigni dalla rana. Preparare aghi di vetro tirando pasta di pipette su una fiamma.

Dopo aver affilato l'estremità sottile della pipetta sotto il microscopio stereoscopico, collegare la pipetta a un tubo di aspirazione in plastica. Per iniziare il prelievo di sangue, tagliare la pelle sopra la parte posteriore della zampa della rana anestetizzata per esporre la vena tarsale dorsale. Riempire l'ago di vetro con uno o due millilitri di soluzione di PBS A freddo ghiacciato più eparina.

Quindi inserire l'ago di vetro nella vena e iniziare a raccogliere il sangue aspirando lentamente con la bocca. Da un singolo esemplare di rana di dimensioni medie è possibile ottenere da uno a due millilitri di sangue. La piccola incisione sulla gamba della rana non necessita di punti di sutura.

La ferita guarirà entro una settimana. Qui sono mostrati i risultati di un'analisi al microscopio stereoscopico del rigetto del trapianto cutaneo a 12 giorni dal trapianto. Una rana LG six clonata che ha ricevuto un innesto cutaneo da un donatore LG six identico per MHC non ha mostrato alcun rigetto.

L'asterisco indica la pinzetta del marcatore non dovuta al rigetto. Al contrario, una rana LG6 clonata che ha ricevuto un innesto cutaneo da un donatore allogenico con MHC differente mostra un rigetto dell'80%. In entrambe le immagini, le frecce indicano cellule pigmentate iridee argentate che contrassegnano tessuto innestato sano e non rigettato.

Nel prossimo esperimento, LG 15 pls sono stati stimolati con un PBS come controllo negativo, con GP 96 ricombinante purificato da una coltura di e coli o con GP 96 purificato da cellule di tessuto tumorale 15 zero. Successivamente, sono stati trasferiti in modo adottivo in riceventi adulti LG 15 e, tre giorni dopo, cellule tumorali 15 zero vive sono state trapiantate mediante iniezione sottocutanea. I tumori comparsi nei giorni successivi alla sfida sono stati monitorati e la dimensione tumorale è stata misurata periodicamente. In questi grafici, ogni curva rappresenta la cinetica della crescita tumorale in una rana. I risultati mostrano che gli animali sensibilizzati con 0,5 o con un microgrammo di GP 96 hanno presentato un ritardo significativo nell'insorgenza del tumore rispetto ai gruppi di controllo. Pertanto, GP 96 facilita la presentazione incrociata degli antigeni tumorali in xenopus.

Abbiamo appena illustrato come esplorare la capacità della GP96 di presentare sia antigeni minori sia antigeni tumorali nella rana Xenopus laevis mediante saggi di trapianto cutaneo e di trapianto tumorale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare il prelievo del lavaggio peritoneale se un vaso sanguigno è stato danneggiato, poiché la maggior parte delle cellule presenti sono eritrociti e non macrofagi. È inoltre fondamentale evitare di schiacciare il tessuto con la pinzetta durante la manipolazione del trapianto cutaneo, per prevenire danni.

Ecco fatto. Grazie per aver eseguito il lavaggio e buona fortuna con i vostri esperimenti.