Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

Per modellare la compliance dei tessuti in vivo utilizzando idrogeli di acrilammide. Questo viene realizzato innanzitutto generando coprioggetti reattivi inferiori e coprioggetti superiori silanizzati. Il secondo passaggio della procedura consiste nel versare e creare gli idrogeli di acrilammide.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel legare mediante cross-linking la proteina della matrice extracellulare scelta all'idrogel. L'ultimo passaggio della procedura è l'incubazione e l'analisi delle cellule. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come la compliance variabile della matrice extracellulare in vitro regoli il comportamento cellulare mediante analisi condotte con microscopia a immunofluorescenza, PCR quantitativa in tempo reale e western blotting.

Oggi vi mostreremo la procedura per la preparazione e l'uso di idrogeli in acrilammide. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare in che modo la rigidità della matrice extracellulare regola la morfologia cellulare, il segnale cellulare e la proliferazione. Cominciamo dunque.

Iniziare questa procedura generando coprioggetti reattivi. Posizionare prima uno strato di paraform sul fondo di una piastra di Petri da 150 millimetri. Successivamente, trasferire fino a nove coprioggetti da 25 millimetri sterilizzati in autoclave sul film di para e coprirli con un millilitro di idrossido di sodio 0,1 molare.

Incubare i coprioggetti per tre minuti. Dopo l'incubazione, aspirare l'idrossido di sodio con una linea a vuoto lavorando sotto cappa chimica, quindi pipettare 0,5 millilitri di trimetilsililamino (tre A-P-T-M-S) su ciascun coprioggetto. Incubare i coprioggetti per tre minuti, quindi aspirare il tre A-P-T-M-S. Prestare attenzione a non prolungare troppo l'incubazione per evitare la formazione di schiuma sul coprioggetto.

Striscioli dopo il trattamento. Risciacquare gli striscioli una volta con 20 millilitri di acqua deionizzata nella stessa piastra. Rimuovere gli striscioli dalla piastra utilizzando pinzette curve e trasferirli, con il lato trattato rivolto verso l'alto, in una nuova piastra da 150 millimetri.

Quindi lavare nuovamente i coprioggetti con acqua deionizzata e posizionarli sul rocker per 10 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere l'acqua e lavare altre due volte. È molto importante rimuovere tutto il tre A-P-T-M-S affinché non reagisca con il glutaraldeide e non lasci un precipitato bianco opaco 10 minuti prima dell'uso del glutaraldeide.

Utilizzando pinze curve, trasferire i coprioggetti in una piastra pulita rivestita con paraffina e aspirare qualsiasi liquido residuo utilizzando una linea a vuoto; quindi ricoprire completamente ciascun coprioggetto con 0,5 millilitri di glutaraldeide allo 0,5% in acqua deionizzata sterile per formare legami incrociati tra i tre A-P-T-M-S e il gel di poliacrilamide. Incubare i coprioggetti per 30 minuti in una cappa chimica. Successivamente, aspirare la soluzione di glutaraldeide e lavare nuovamente i coprioggetti con acqua deionizzata.

Quindi asciugare completamente le lamelle. Aggiungere nuove lamelle in un tubo Falcon da 50 millilitri contenente una soluzione al 10% di sigillante superficiale in cloroformio e agitare per almeno 10 minuti. Decantare la soluzione sigillante e lasciare asciugare all'aria.

Posizionare i coprioggetti su salviette Kim nel cabinet di sicurezza biologica dove verrà avviata la preparazione degli idrogeli. Utilizzare pinzette curve per trasferire i coprioggetti con il lato reattivo rivolto verso l'alto su un foglio di paraformaldeide che è stato fissato con nastro adesivo sulla superficie del cabinet di sicurezza biologica. Assicurarsi che i coprioggetti siano ben appiattiti sulla superficie di paraformaldeide.

Quindi preparare una soluzione satura di CIN o di NHS contenente idrossi in toluene sciogliendo una piccola quantità di NHS in toluene sufficiente. Per esperimenti specifici, aggiungere piccole quantità di NHS finché l'NHS non si scioglie più. La soluzione satura è solitamente torbida e di colore rosa.

Successivamente, preparare l'acrilamide, il BIS acrilamide, l'acqua e un PS per raggiungere la percentuale desiderata di acrilamide. Aggiungere i reagenti ai tubi monouso come indicato nel protocollo scritto. Quindi, un'aliquote alla volta.

Aggiungere l'NHS e il TM me. Vortexare brevemente il tubo e versare immediatamente da tre a cinque gel utilizzando 140 microlitri per coprislip all'interno delle cappe a sicurezza biologica. Posizionare rapidamente il coprislip SILICONATO da 25 millimetri sopra ciascun gel prima che inizi a polimerizzare.

L'aggiunta del coprioggetto superiore permetterà all'acrilamide di ricoprire completamente il coprioggetto inferiore. Incubare questo sandwich a temperatura ambiente fino a quando l'acrilamide si polimerizza, per determinare quando è avvenuta la polimerizzazione. Controllare la soluzione residua di acrilamide nel tubo da microcentrifuga.

La polimerizzazione richiederà alcuni minuti per i gel rigidi e un po' più tempo per i gel morbidi. Una volta avvenuta la polimerizzazione, sollevare con attenzione il sandwich indossando guanti sterili. Successivamente, far scivolare via il coperchio superiore fino a quando non sporge rispetto al gel polimerizzato.

Quindi sollevare il coperchio. Rimuovere il gel e scartare il coperchio superiore. Posizionare ciascun coperchio inferiore del gel, d'ora in poi denominato idrogel, in una piastra a sei pozzetti.

Successivamente, aggiungere due millilitri di soluzione salina fosfato o PBS per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Quindi lavare gli idrogeli con PBS e incubare su un agitatore per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio due volte.

Per iniziare l'esperimento, coprire ciascun idrogel con due millilitri di una soluzione di fibronectina o di un'altra proteina della matrice extracellulare. Incubare la proteina sull'idrogel tutta la notte a quattro gradi Celsius per consentirne il legame covalente all'idrogel; dopo l'incubazione notturna, aspirare la soluzione di ECM. Quindi bloccare i gruppi NHS non reattivi con un milligrammo per millilitro di albumina sierica bovina priva di acidi grassi attivata termicamente, in un mezzo privo di siero, e incubare per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, lavare gli idrogeli una volta con PBS sterile. Successivamente, piastrare le cellule nel mezzo di coltura appropriato contenente siero bovino fetale sull'idrogel qui.

Si utilizzano fibroblasti embrionali di topo già stabiliti. Determinare il numero di cellule da seminare sull'idrogel in base al grado di espansione e di confluenza cellulare richiesto per l'esperimento. Sono necessarie circa 10 alla cinque cellule per l'analisi mediante western blot e PCR quantitativa.

Quindi incubare le cellule nelle condizioni appropriate per il tipo cellulare specifico. Al termine del periodo di incubazione, estrarre le proteine cellulari o l'mRNA secondo le necessità.

Pipettare gocce da 100 microlitri di buffer di lisi su un foglio di paraform sulla superficie del bancone del laboratorio, lasciando circa due-tre centimetri tra ogni goccia. Successivamente, rimuovere con attenzione ciascun idrogel sollevando il coprivetrino inferiore dal pozzetto. Utilizzare pinzette curve e posizionare il lato cellulare verso il basso sulla sommità delle gocce.

Incubare le cellule con il buffer di lisi per esattamente un minuto. Infine, rimuovere i coprioggetti e trasferire il buffer di lisi in una provetta per microcentrifuga. In alternativa, quando si estrae l'RNA, trasferire ogni idrogel in una nuova piastra a sei pozzetti e aggiungere un millilitro di triazolo per ogni pozzetto.

Incubare i gel per tre minuti dopo l'incubazione. Rimuovere la soluzione di trialzolo per la conservazione in un tubo da microcentrifuga. Un accurato lavaggio delle lamelle dopo l'aggiunta di A-P-T-M-S è un passaggio importante per produrre lamelle reattive.

Vetrini correttamente lavati e asciutti sono privi di qualsiasi residuo di precipitato. L'A-P-T-M-S reagirà con il glutaraldeide e produrrà un precipitato bianco e torbido. Se è presente il precipitato, l'intera procedura deve essere ripetuta poiché il vetrino non è più utilizzabile.

Dopo la formazione dell'idrogel e il rivestimento con proteine della matrice extracellulare, le cellule vengono seminate e lasciate incubare tutta la notte. Esiste una differenza evidente nella distensione cellulare su idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi, come si può osservare mediante la colorazione e il confronto tra fibroblasti embrionali di topo, che si distendono maggiormente su idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi. In effetti, la maggior parte delle cellule che aderiscono a un idrogel morbido rimarrà compatta e aderirà in modo meno efficiente.

Risultati rappresentativi di PCR quantitativa dei livelli di mRNA di ciclina D1 in fibroblasti embrionali di topo mostrano che la ciclina D1 è significativamente sovraespressa su una matrice rigida, ma non su una matrice morbida. Questo suggerisce che la rigidità della matrice regola il progresso del ciclo cellulare in vitro. Vi abbiamo appena mostrato come generare idrogeli di diversa rigidità, modellando le condizioni fisiologiche in vivo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preparare coprioggetti reattivi extra, poiché possono verificarsi incidenti ed errori.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.