I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Topi transgenici per recettori specifici di antigeni delle cellule T si sono rivelati indispensabili nello studio dello sviluppo e della funzione delle cellule T, al fine di generare modelli murini con specificità predefinite del recettore delle cellule T mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche o SCNT. Un topo viene infettato con un patogeno di interesse. Le cellule T vengono isolate dal topo e successivamente purificate mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.

I linfociti T purificati vengono quindi utilizzati per il trasferimento nucleare di cellule somatiche. Dopo che gli embrioni raggiungono lo stadio di blastula, vengono isolate cellule staminali embrionali. Queste cellule vengono quindi iniettate in blastocisti, che a loro volta vengono trasferite in topi pseudo-gravidi.

I cuccioli risultanti mostrano un marcato aumento della popolazione di cellule T di interesse, che può essere convalidato mediante analisi PAX. Ciao, mi chiamo Okta AK e sono un post dottorato presso l'Istituto White per la Ricerca Biomedica. Oggi vi mostrerò come eseguire iniezioni somatiche di trasferimento blastocistico assistito da CLE, nonché il trasferimento embrionale.

Il vantaggio principale del trasferimento somatico è che possono essere generati modelli murini che esprimono il loro recettore per cellule T dal locus endogeno, e quindi sotto il controllo del promotore endogeno, e che tali modelli murini possono essere ottenuti molto rapidamente. Il trasferimento somatico in forma liquida può essere utilizzato come strumento per generare modelli murini con specificità predefinite di recettori per cellule T o per cellule B. Questo è di particolare interesse per chi lavora in campi come l'autoimmunità, le malattie infettive e il cancro.

Per isolare linfociti T specifici per un patogeno come Toxoplasma gondii, si infetta il topo donatore mediante iniezione intraperitoneale e si prelevia la milza al culmine della risposta immunitaria; le cellule omogeneizzate del donatore vengono quindi isolate e incubate con anticorpi marcati fluorescentemente e il tetramero appropriato. Infine, si esegue il sorting mediante citometria a flusso per ottenere linfociti T specifici per il patogeno. La sera prima della procedura di enucleazione degli oociti.

Preparare aghi per iniezione piso di quattro, cinque e sette micrometri utilizzando una siringa per caricarli retrogradamente con mercurio. Il giorno successivo, iniziare il protocollo di trasferimento nucleare di cellula somatica raccogliendo gli oociti, quindi, mediante pipetta a bocca, trasferirli in gocce di mezzo K-S-O-M-A-A in una piastra di Petri. Nel coperchio della piastra di Petri.

Preparare una piastra per eseguire il trasferimento nucleare di cellule somatiche o SCNT posizionando circa 10 gocce di PVP. Aggiungere circa 10 gocce di HCZB contenente cinque microgrammi per millilitro di citocalasina B e circa 10 gocce di HCCB contenente 2,5 microgrammi per millilitro di citocalasina B. Questa piastra sarà indicata come piastra S-C-N-T-A. Posizionare la piastra S-C-N-T-A sul portapreparati di un microscopio composto invertito.

Successivamente, inserire un ago per enucleazione di sette micrometri nel micro manipolatore e lavarlo aspirando e scartando la soluzione di PVP da cinque a 10 volte. Trasferire quindi da 10 a 30 cellule arrestate in metafase II dalla piastra di Petri in una delle gocce di HCCB con cinque microgrammi per millilitro di citocalasina B sulla piastra S-C-N-T-A e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, allineare gli oociti in orizzontale.

Trascorsi cinque minuti, utilizzare l'ago per enucleazione per posizionare un ovocita davanti all'ago di ritenzione. Utilizzando un microiniettore, applicare un vuoto per fissare l'ovocita all'ago di ritenzione della micropipetta.

Successivamente, utilizzando l'ago per enucleazione, ruotare l'ovocita finché il complesso cromosomico del fuso, che appare ipertrasparente rispetto al citoplasma opaco, si trovi nella posizione delle tre in punto; quindi attivare un impulso piezoelettrico premendo il pedale per penetrare la zonapellucida. Un impulso piezoelettrico è un impulso meccanico che si propaga longitudinalmente e fa vibrare la punta dell'ago di enucleazione. Le vibrazioni della punta facilitano la perforazione della zonapellucida.

Dopo aver attraversato la zona pellucida, posizionare l'apertura dell'ago di nucleazione adiacente al fuso della metafase II ed applicare il vuoto. Il complesso cromosomico del fuso si sposterà lentamente all'interno dell'ago. Una volta rimosso l'ago, la membrana dovrebbe sigillarsi autonomamente.

Infine, utilizzando una pipetta a bocca, trasferire i citi enucleati nuovamente nelle gocce di K-S-O-M-A-A. Successivamente, utilizzando la stessa pipetta, lavarli trasferendoli da una goccia all'altra di KSOM AA. Per eseguire il trasferimento nucleare, sostituire l'ago da sette micrometri utilizzato per l'enucleazione sul micromanipolatore con un ago da quattro a cinque micrometri destinato al trasferimento nucleare. Lavare l'ago con PVP come in precedenza.

Posizionare le cellule T CD8 positive isolate in precedenza in una goccia di PVP sulla piastra S-C-N-D-A. Mescolare bene e incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire da 10 a 30 cellule ENUCLEATE in una goccia di HCZB contenente 2,5 microgrammi per millilitro.

Cyto B sulla piastra S ct. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, utilizzare l'ago per il trasferimento nucleare per allineare i citi in orizzontale usando l'ago di iniezione.

Prelevare una cellula donatrice CD8 positiva dal mezzo PVP e aspirarla avanti e indietro finché la membrana esterna non si sarà disintegrata. Se necessario, applicare un impulso piezoelettrico: frammenti di membrana e citosol dovrebbero risultare visibili. Aspirare il nucleo all'interno dell'ago.

Quindi continuare a raccogliere nuclei fino a quando non ce ne sono da 10 a 30. Successivamente, spostarsi sulla goccia contenente gli oociti anucleati allineati. Applicare il vuoto per fissare un oocita all'ago di ritenzione.

Quindi posizionare l'ago per il trasferimento nucleare NU accanto alla zona pellucida con i nuclei orientati in direzione opposta rispetto all'apertura. Applicare un impulso piezoelettrico fino a quando l'ago non ha attraversato la zona pellucida. Spingere il micromanipolatore per spostare con attenzione un nucleo fino alla punta dell'ago.

Inserire l'ago nell'oocita fino a quando la punta dell'ago si trova a due terzi della profondità totale. Applicare una leggera pressione negativa in modo che una piccola parte della membrana dell'oocita entri nell'ago. Il passaggio successivo è molto critico.

Poiché è l'unico momento in cui l'ovocita è effettivamente aperto. Applicare un singolo impulso ZO. Quindi applicare una pressione positiva per spingere il nucleo fuori dall'ago.

Ritirare con attenzione l'ago in modo che la punta si trovi a circa un terzo della profondità nell'ovocita, quindi applicare una pressione negativa e continuare a ritirare l'ago. Per sigillare l'ovocita. Ripetere questo passaggio con ogni ovocita.

Dopo che tutti gli oociti hanno ricevuto un nucleo, trasferirli nella piastra di Petri e lavarli spostandoli da una goccia all'altra di mezzo KS OM AA, quindi incubare a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire gli embrioni SCN T in gocce di mezzo di attivazione senza calcio contenente cloruro di stronzio. Il cloruro di stronzio attiva l'ocite inducendo oscillazioni del calcio che si verificherebbero in modo simile durante la fecondazione.

Incubare per sei ore. Se desiderato, aggiungere TSA, un inibitore non specifico delle istone deacetilasi, al mezzo di attivazione. Al fine di valutare l'efficienza successiva all'attivazione, esaminare gli embrioni al microscopio invertito per determinare la quantità di pseudo pronuclei o embrioni SCNT positivi per PPN. I PPN possono essere identificati in base al loro aspetto.

Sembrano uova. Lavare e coltivare alla maniera "sunny side up". Gli embrioni e le gocce di K-S-O-M-A-A vengono incubate per tre giorni e mezzo a 37 gradi Celsius fino al raggiungimento dello stadio di blastocisti.

All'inizio, dovresti concentrarti sull'esecuzione corretta delle procedure che ti abbiamo appena mostrato per la nucleazione e il trasferimento nucleare NU. Una volta padroneggiate queste tecniche, le procedure successive saranno più facili da gestire. Le cellule staminali embrionali o cellule ES utilizzate qui sono state ottenute mediante tecniche standard.

Questi devono essere preparati nel giorno dell'iniezione assistita da blast, tre giorni e mezzo dopo il coito. Preparare il coperchio di una piastra batteriologica sterile piastrando gocce contenenti PVP e HCZP. Quindi preparare un ago per iniezione da 15 micrometri per l'impulso piso come in precedenza.

Successivamente, posizionare l'ago di iniezione nel micromanipolatore e lavarlo con il trasferimento di PVP. Eseguire da 10 a 30 assist di blast in una goccia di HCZB. Quindi, posizionare da cinque a cinquanta microlitri della sospensione ESL in un'altra goccia di HCZB.

Devono essere presenti abbastanza cellule staminali embrionali (ES) da poter essere facilmente raccolte, ma senza essere troppo fitte. Successivamente, raccogliere da 30 a 100 cellule staminali embrionali con l'ago di iniezione. Procedere quindi alla goccia con il blast assist.

Allineare orizzontalmente l'assistente per la blastocisti e fissarne uno con l'ago di contenimento applicando il vuoto. Utilizzare l'ago di iniezione per ruotare l'assistente per la blastocisti finché la massa cellulare interna non si trova alle nove in punto. Posizionare l'ago di iniezione alle tre in punto.

Assicurarsi che non ci siano cellule staminali embrionali sulla punta dell'ago e applicare un impulso piso fino a quando l'ago di iniezione penetra attraverso la zop lucita e la trifecta nel sigillo blastico. Rilasciare da cinque a quindici cellule staminali embrionali in modo che aderiscano alla massa cellulare interna. Proseguire fino a quando tutti i blast assist sono stati iniettati; al termine delle iniezioni, concludere l'operazione.

Lavare due volte in K-S-O-M-A-A e procedere al trasferimento chirurgico dell'embrione in femmine pseudogravide, posizionando la ricevente femmina pseudogravida anestetizzata nell'area chirurgica. Utilizzando un rasoio elettrico, rimuovere i peli dal quadrante inferiore destro. Disinfettare la zona utilizzando una soluzione a base di iodio e alcol al 70% sotto un microscopio stereoscopico.

Usare le forbici per aprire la pelle, quindi inserire le forbici chiuse tra la pelle e il peritoneo e aprirle per separare il peritoneo dalla pelle. Individuare l'ovaio attraverso il peritoneo, che dovrebbe apparire come una macchia rossa. Quindi usare le forbici per aprire il peritoneo in quella zona.

Utilizzare una pinzetta per afferrare con cura il dotto uterino comune (UCT) o il tessuto adiposo circostante ed estrarre l'utero mediante una capillare collegata a una pipetta azionata dalla bocca. Prelevare un gruppo di circa 10 blastocisti tenendo l'ovidotto e l'utero con la pinzetta. Utilizzare un ago per praticare un piccolo foro nell'utero.

Quindi inserire il capillare con l'ausilio della blast nell'ampolla uterina e rilasciarli. Riposizionare l'utero all'interno della cavità addominale. Individuare i margini del peritoneo e chiuderli con alcuni punti di sutura.

Chiudere la cute del topo con alcune graffette. Somministrare un antidolorifico per via sottocutanea. Successivamente, trasferire il topo nella sua gabbia sotto una lampada riscaldante.

Monitorare la respirazione del topo fino al suo risveglio. Successivamente all'enucleazione e al trasferimento nucleare di cellule somatiche. Circa il 70% degli embrioni era positivo per i pseudopronuclei.

Come mostrato in questa figura, il trattamento con TSA per sei o dieci ore non ha avuto alcun effetto. Dopo tre giorni e mezzo di coltura, dal 5 al 10% degli embrioni si è sviluppato in blastoisti.

Anche in questo caso, l'aggiunta di TSA non ha avuto alcun effetto sulla velocità di sviluppo del blasto assistito. I blasto assistiti SCNT sono stati quindi utilizzati per ottenere cellule staminali embrionali. TSA ha migliorato significativamente la frequenza con cui le ESL sono state derivate dal blasto assistito.

Le cellule S-C-N-T-E-S vengono utilizzate per generare topi chimerici. Viene prelevato sangue da questi topi e analizzato per rilevare la presenza di specifiche cellule T mediante analisi facts, come mostrato qui. Quando il sangue viene colorato con anticorpo anti-CDA e tetramero specifico, può essere identificata una popolazione doppio positiva.

Indica che la cellula donatrice utilizzata per il trasferimento nucleare da cellule somatiche (SCNT) era della specificità corretta. Vi ho appena mostrato come eseguire il trasferimento nucleare da cellule somatiche, le iniezioni assistite da blastocisti e il trasferimento di embrioni. Il punto più importante da considerare è la purezza delle vostre cellule T o cellule B.

Dopo aver appreso come eseguire il trasferimento somatico e una volta che i vostri embrioni hanno raggiunto lo stadio di blastocisti, potete scegliere se trasferirli direttamente in femmine pseudo-gravide oppure utilizzarli per ricavare cellule staminali embrionali e generare topi chimerici.