Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

Ciao, sono Raja Ti, dottorando presso il Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Vi guiderò attraverso i passaggi necessari per l'illustrazione tridimensionale della modificazione orientale che contrassegna il danno al DNA e la condensazione cromatica in una nuova cellula cardiaca. Il DNA è avvolto intorno a zone nucleari.

Ogni nucleosoma è composto da quattro tipi diversi di istoni: H due A, H due B, H tre e H quattro radi. La formazione di rotture del DNA è contrassegnata dalla fosforilazione di H due X. Questa fosforilazione di H due X si verifica principalmente nelle regioni di cromatina marcate dalla metilazione di H tre K quattro. Ora esamineremo l'illustrazione tridimensionale delle modificazioni nella cellula, immunoetichettata con l'anticorpo anti-fosfo H due X e l'istone H tre K quattro metilato.

Iniziamo. Preleviamo il campione della sospensione cellulare e lo poniamo in provette Falcon da 15 ml. Le cellule vengono lavate due volte con PBS mediante centrifugazione a 150 ×g e successiva risospensione.

Sospendere nel mezzo fresco per osservare l'effetto immediato delle radiazioni sugli eventi cellulari. Mantenere le cellule sotto osservazione per cinque-dieci minuti prima e durante l'esposizione alle radiazioni. Esporre le cellule a radiazioni gamma o raggi X. Dopo l'irradiazione, distribuire tre millilitri della sospensione cellulare in ciascuna GU di sei.

Piastra a pozzetti per il picco di gamma H2AX: incubare le cellule tra 30 minuti e un'ora a 37 gradi centigradi. Utilizziamo la citospina per depositare le cellule non aderenti su vetrini di vetro. Durante il montaggio della clip per citospina, assicurarsi che l'intero filtro coincida con il imbuto.

Dispensare un volume di 50 microlitri, tamponare questa sospensione cellulare in ciascuna posizione finale della citosina, inserire le clip di citosina nella missione citosina e centrifugare a 500 giri al minuto per cinque minuti. Rimuovere le clip di citosina e separare i vetrini dalla scheda filtrante. Non lasciare asciugare all'aria le cellule troppo a lungo, poiché ciò potrebbe influenzare lo sfondo nella colorazione con fluoresceina.

Utilizzando un pennino con punta liquida, si tracciano cerchi intorno a ogni striscio; quindi si fissano le cellule con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per cinque minuti. Rispetto all'etanolo o all'olio, una fissazione migliore è stata osservata con paraformaldeide al 4%. Successivamente, si incubano i vetrini con PBS contenente cellule permeabilizzate con Triton X-100 a temperatura ambiente per cinque minuti.

Rispetto al doppio 80, abbiamo osservato un segnale migliore nelle cellule trattate con Triton X-100. Osservare le cellule con PP S3 per tre volte, ciascuna per cinque minuti. Bloccare le cellule in BSA per una persona per 10 minuti a temperatura ambiente e ripetere questa procedura tre volte, confrontando con altri agenti e tempi di bloccaggio.

La BSA si è rivelata la più efficace nel ridurre al minimo il legame non specifico degli anticorpi primari; abbiamo utilizzato due anticorpi primari diluiti uno a 500 con il 1% di BSA, impiegando circa 50 microlitri di anticorpo primario per ogni vetrino. L'incubazione dell'anticorpo primario a temperatura ambiente per 60 minuti riduce la colorazione di fondo rispetto all'incubazione notturna a quattro gradi centigradi. Lavare le cellule tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna.

Alexa floor 4 88, buon anti topo e Alexa floor 5 46 parola anti coniglio. Gli anticorpi secondari sono stati utilizzati per rilevare contemporaneamente marcatori diversi. Utilizzare anticorpi prodotti in specie diverse.

Aggiungere circa 50 microlitri di anticorpo secondario diluito su ogni vetrino. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 90 minuti. Si raccomanda di incubare le cellule nella camera umida per evitare che le cellule e l'anticorpo si asciughino; lavare i vetrini con PBS 3 volte, ciascuna per cinque minuti.

50 microlitri di una diluizione 1:500 di topo three in PBS sono stati aggiunti a ciascun vetrino. Lavare i vetrini con PBS per tre volte, ciascuna per cinque minuti. Rimuovere l'eccesso di umidità dai vetrini e aggiungere la soluzione Antifa.

Si raccomanda di non far asciugare completamente le cellule prima di aggiungere la soluzione Antifa. Posizionare un coprioggetto sul vetrino. È necessario fare attenzione per evitare la formazione di bolle d'aria.

Lasciare i vetrini durante la notte in una camera umida al buio. Sigillare il vetrino con lo smalto per unghie per evitare l'essiccazione delle cellule. Le immagini acquisite al microscopio confocale rivelano.

Una migliore risoluzione spaziale è andata persa e sono stati utilizzati laser a elio per l'acquisizione delle immagini. Un obiettivo ad immersione in olio da 63 è preferito rispetto a obiettivi con ingrandimento maggiore o minore. Un fattore di zoom pari a tre o quattro produrrà un'immagine con risoluzione migliore.

Per la contabilità delle FO provenienti da molte cellule, è preferibile utilizzare una velocità di scansione pari a otto e una dimensione dell'immagine di 1024 per 1024 pixel per cella. Quando si esegue l'acquisizione per più canali, si consiglia una scansione sequenziale per righe piuttosto che per fotogrammi. Per evitare lo sbiancamento del campione, il guadagno del rivelatore e l'offset dell'amplificatore vengono regolati per ridurre il rumore e la saturazione del segnale.

Considerato che la dimensione di Kama HX X quattro può essere inferiore a 0,5 micrometri, si raccomanda di acquisire immagini con un passo minimo di almeno 0,5 micrometri. Le immagini lungo l'asse del getto devono essere acquisite in un modello a serie di getti utilizzando il modello "mark first" e "mark lost". Per illustrare la relazione spaziale tra diverse proteine, si raccomanda di utilizzare una velocità di scansione pari a sei con una dimensione dell'immagine di 2048 e 2 48 pixel, impiegando Metamor first.

Il secondo può essere contato a partire da immagini acquisite con diversi microscopi confocali. Aprire i tag dell'immagine gamma hgx direttamente dal menu file o utilizzando i numeri di riferimento. Andare al menu processa e selezionare aritmetica dello stack.

Scegliere la proiezione massima e selezionare i piani da includere. Quindi fare clic su OK. Ora scegliere il filtro Top Hat e selezionare l'immagine Gamma H2AX come immagine sorgente, quindi applicare.

Filtro a cappello top e immagine risultante saranno un'immagine binaria con meno rumore e una ridotta variazione nell'intensità dei fuochi. Vai alle regioni e seleziona lo strumento di disegno delle regioni, quindi disegna regioni attorno ai nuclei. Vai al menu Elabora e seleziona l'opzione Soglia immagine.

Scegliere la soglia di inclusione e impostare i valori della soglia inferiore e superiore. Di solito sono i valori della soglia a influenzare il numero quattro. Il valore ottimale della soglia è quello che minimizza l'inclusione dello sfondo e massimizza l'inclusione della struttura in esame.

Questo può essere ottenuto al meglio contando il numero di escursioni utilizzando diversi valori di soglia. Quindi confrontare il numero di escursioni con il conteggio ad occhio nudo. Selezionare l'immagine DPI e andare al menu delle regioni e scegliere l'opzione di trasferimento delle regioni.

Ora abbiamo immagini corrispondenti di forai e nuclei pronte per il conteggio. La maggior parte delle regioni nucleari viene trasferita nel top hat. Vai al menu Misura e seleziona l'analisi integrata delle aree o IMA, seleziona Misura tutte le regioni e fai clic su Misura per ottenere il numero FTE.

Ora i numeri di FTE di ogni regione possono essere esportati in un foglio elettronico utilizzando l'opzione Dati di registro. Aprire le immagini del proiettore a getto create in precedenza per ogni canale. Andare su Visualizzazione e selezionare Allineamento colore.

Selezionare le rispettive immagini sorgenti per ogni canale per creare un'immagine combinata per tutti e tre i canali. L'analisi della scansione lineare viene eseguita per illustrare la posizione spaziale dei diversi marcatori nel nucleo. Accedere al comando delle barre degli strumenti di misura e selezionare l'analisi della scansione lineare tracciando una linea attraverso la cellula.

Questo creerà un grafico che mostra l'intensità fluorescente di ogni canale lungo la linea e rappresenta la distanza tra diversi marcatori l'uno rispetto all'altro. Per creare un'immagine 3D da una serie di immagini, andare al menu serie e selezionare ricostruzione 3D. Selezionare il tipo di ricostruzione 3D massimo.

Scegliere il piano di rotazione, scegliere la distanza di calibrazione del getto. Di solito l'utente specifica e fa clic su OK per creare una ricostruzione 3D. E questo conclude il nostro protocollo per l'immunofluorescenza, la colorazione e l'analisi delle immagini.

In sintesi, il microscopio confocale a immunofluorescenza è una tecnica per la visualizzazione tridimensionale di diversi marcatori C e di gamma H2AX nel nucleo cellulare. Grazie per aver guardato.