Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la facilità di esecuzione di un immunoblotting quando si utilizzano prodotti adeguati. Dopo la preparazione del campione, le proteine vengono separate in base alla dimensione e successivamente trasferite su una fase solida. Le proteine vengono quindi rivelate mediante anticorpi; l'uso di protocolli corretti e di reagenti di alta qualità ed economici consente di ottenere risultati migliorati nell'immunoblotting.

Ciao, sono Jesse Luhan, scienziato R&S di EMD Chemicals a San Diego, in California. EMD è un'affiliata di Merck KGaA di Darmstadt, in Germania. Oggi vi mostreremo una procedura di western blotting.

Iniziamo. Il primo passaggio del western blot è la preparazione del campione. Iniziare la preparazione del campione centrifugando le cellule a bassa velocità, ad esempio per cinque minuti a 2.500 ×g.

Dopo la centrifugazione, eliminare il sovranatante dai pellet cellulari. Sospendere accuratamente le cellule nel reagente di estrazione proteica CytoBuster, utilizzando 150 microlitri per 10⁶ cellule. Incubare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti.

Successivamente, centrifugare il campione per cinque minuti a 16.000 ×g a quattro gradi Celsius. Trasferire il SNA chiarificato in una nuova provetta e procedere con l'analisi. Dopo aver determinato la concentrazione proteica del campione, preparare il campione per il caricamento sul gel al fine di denaturare le proteine.

Utilizzare un buffer campione contenente un detergente denaturante anionico come il dodecilsolfato di sodio o SDS. Far bollire la miscela a 95-100 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando un gel preconfezionato disponibile in commercio, le proteine possono essere rapidamente separate in base al peso molecolare.

Riempire l'apparecchio di elettroforesi con il buffer di corsa, che può essere preparato con reagenti della linea chimica Omni PU. Caricare la prima corsia del pozzetto con il marcatore proteico trail mix. Questo marcatore presenta tre bande di riferimento che permettono il monitoraggio durante l'elettroforesi.

Dopo la colorazione del gel, sono visibili 10 bande, con pesi molecolari compresi tra 10 e 225 chilo Dalton. Caricare il campione denaturato nelle rimanenti pozzetti. Eseguire l'elettroforesi a 220 volt per un'ora.

Dopo la separazione delle proteine, colorare il gel con blu kumasi per verificare che le proteine si siano migrate in modo uniforme ed equilibrato, utilizzando una colorazione rapida e ultrasensibile, pronta all'uso, senza necessità di DS. Proprio come le proteine con carica elettrica possono essere indotte a migrare attraverso un gel in un campo elettrico, anche le proteine possono essere trasferite in un campo elettrico dal gel a una membrana, come NITROCELLULOSA o PVDF. Quando si utilizzano membrane PVDF, immergere la membrana in metanolo per alcuni minuti, seguito da un'equilibratura in tampone di trasferimento ghiacciato per cinque minuti. Immergere anche il gel per alcuni minuti nel tampone di trasferimento ghiacciato; l'equilibratura impedisce il restringimento del gel durante il trasferimento.

Per un trasferimento umido, assemblare un sandwich costituito da gel e membrana tra spugna e carta. Quindi bloccare saldamente l'insieme dopo aver verificato che non si siano formate bolle d'aria tra il gel e la membrana. Immergere il sandwich nel buffer di trasferimento e applicare un campo elettrico.

Le proteine cariche negativamente migreranno verso l'elettrodo carico positivamente. La membrana le fermerà, si legherà a esse e ne impedirà l'ulteriore avanzamento. Al termine del trasferimento, visualizzare le proteine per verificare un trasferimento uniforme e l'assenza di sacche d'aria.

Questo può essere facilmente eseguito con il colorante per immunoblot di allerta rossa. Questo colorante è pronto all'uso e la decolorazione può essere effettuata facilmente con acqua. Questo è il gel dopo essere stato decolorato mediante lavaggio in acqua; prima che la membrana possa essere sottoposta a prova con l'anticorpo, la membrana viene bloccata.

Per evitare il legame non specifico, bloccare la membrana utilizzando reagenti di blocco di alta qualità. Per prevenire un aumento dello sfondo, incubare la membrana in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata, quindi lavare la membrana tre volte in TBST o PBST dopo l'incubazione. Questi tamponi possono essere facilmente e convenientemente preparati utilizzando rispettivamente compresse di TBS tween e compresse di PBS tween.

Dopo aver bloccato e lavato la membrana, è possibile incubarla con l'anticorpo primario. Applicare l'anticorpo primario utilizzando la soluzione, uno dei componenti per l'amplificazione del segnale, che consente un notevole potenziamento del segnale stesso. Preparare l'anticorpo primario nella soluzione uno e incubare la membrana per un'ora.

Non è necessario aggiungere ulteriori agenti di blocco dopo l'incubazione. Lavare la membrana con TBST. Successivamente, incubare la membrana con l'anticorpo secondario diluito nella soluzione due del signal boost per un'ora.

Infine, lavare nuovamente la membrana diverse volte con TBST per la rivelazione di anticorpi secondari coniugati con HRP. La rivelazione degli anticorpi secondari mediante chemiluminescenza migliorata o ECL è tradizionalmente utilizzata in questo passaggio. Si utilizza il reagente ECL passaggio rapido poiché non richiede la miscelazione di luminolo o potenziatore.

Applicare semplicemente il reagente sulla membrana per alcune volte, incubare per due minuti e sviluppare utilizzando una pellicola radiografica. Rapid Step offre un'elevata sensibilità nell'ordine dei picogrammi e un'emissione più debole per un periodo fino a due ore dopo l'aggiunta del substrato. I marcatori proteici Trail mix consentono il tracciamento delle proteine durante l'elettroforesi, in confronto ai protocolli standard di Western blot.

Signal Boost consente un intervallo dinamico e una sensibilità maggiori. Infine, una sensibilità superiore può essere ottenuta utilizzando Rapid step invece dei tradizionali reagenti ECL. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la Western blotting in modo efficiente ed economico, grazie a una gamma completa di prodotti.

Ricordate che la qualità dei vostri risultati dipende dalla qualità dei vostri reagenti. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.