Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione
4 dicembre 2010
Qui si descrive un metodo che utilizza la potenza di microiniezione accoppiato con fluorescente In situ al fine di misurare con precisione la cinetica esportazione nucleare di mRNA nelle cellule somatiche dei mammiferi.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la cinetica dell'esportazione nucleare dell'mRNA in cellule di mammifero. Questo viene ottenuto microiniettando prima mRNA o DNA nei nuclei di cellule in coltura tissutale di mammifero. Dopo la microiniezione, i campioni vengono fissati a seguito di diversi periodi di incubazione.
L'mRNA viene quindi colorato mediante ibridazione fluorescente in situ o FISH. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'acquisire immagini delle cellule e quantificare la quantità di fluorescenza nel citoplasma e nel nucleo. In definitiva, la velocità di esportazione dell'mRNA può essere misurata attraverso una combinazione di microiniezione e microscopia fluorescente.
Ciao, sono SRG AV dal laboratorio di Alex Palazzo del Dipartimento di Biochimica dell'Università di Toronto. Sono Stefan Toski, anch'io del laboratorio Palazzo. Sono Amy del laboratorio Palazzo e sono Khi Maha David del laboratorio Palazzo.
Oggi vi mostreremo un procedimento per introdurre mRNA nei nuclei di cellule di colture cellulari di mammifero mediante microiniezione. Inoltre, dimostreremo come colorare l'mRNA mediante ibridazione fluorescente in C due. Utilizziamo questi procedimenti nel nostro laboratorio per studiare la cinetica dell'esportazione nucleare dell'mRNA nelle cellule di mammifero.
Iniziamo. Prima della microiniezione, preparare il DNA plasmidico in tampone di iniezione a una concentrazione compresa tra 50 e 200 microgrammi per millilitro. Successivamente, aggiungere al mix Oregon Green 488 o OG coniugato con destrano da 70 chilodalton per consentire l'identificazione delle cellule iniettate.
Il destrano coniugato con OG aiuterà a determinare la quantità di fluido iniettata nel nucleo e quella fuoriuscita nel centrifugo citoplasmatico. Centrifugare i campioni a 13.000 G e quattro gradi Celsius per almeno 20 minuti per formare un pellet di qualsiasi materiale particolato che potrebbe ostruire la punta dell'ago. Scegliere la linea cellulare di mammifero da microiniettare in base ai criteri descritti nel protocollo scritto riguardo ai costi.
Sette cellule vengono utilizzate per questo seme dimostrativo. Le cellule vengono posizionate su coprioggetti lavati con acido in piastre di Petri da 30 millimetri almeno 24 ore prima della microiniezione. Idealmente, il monostrato cellulare dovrebbe essere approssimativamente dal 70 al 90% confluenziale al momento dell'iniezione, per consentire una facile identificazione delle cellule iniettate; il monostrato cellulare viene ferito prima dell'iniezione utilizzando una punta di pipetta di plastica da 200 microlitri.
Incidi una croce sulla lamellina e lascia le cellule riprendersi nell'incubatrice per colture cellulari per almeno 15 minuti prima dell'iniezione. Per la microiniezione, utilizza un microscopio invertito isolato su un tavolo antivibrante per ridurre al minimo le vibrazioni che potrebbero interferire con il processo di microiniezione. Utilizzando una punta da gel loader einor, preleva circa un microlitro dalla parte superiore del campione centrifugato per evitare di disturbare il pellet.
Inserire la punta della pipetta nell'estremità posteriore di un ago per microiniezione prefabbricato ed espellere il liquido. Il liquido verrà aspirato nella punta dell'ago per azione capillare. Entro cinque-trenta secondi dovrebbe essere visibile un menisco vicino alla punta.
Inserire l'ago riempito di liquido nel supporto e fissarlo al micromanipolatore. A un angolo di 45 gradi, visualizzare l'ago utilizzando l'obiettivo 10x e posizionarlo al centro del campo visivo, vicino al piano focale. Utilizzando le manopole grossolane del micromanipolatore, il supporto è collegato tramite un tubo a una siringa di vetro, che viene utilizzata per generare la pressione necessaria per espellere il liquido dalla punta dell'ago.
Per mantenere una pressione costante, la siringa viene montata su un morsetto per tubo. Utilizzando due tappi di gomma e due morsetti metallici, sollevare l'ago di alcuni millimetri per evitare che venga danneggiato nei passaggi successivi, quindi arretrare il microscopio. Pilastro, aumentare la pressione premendo lo stantuffo della siringa.
Da 0,5 a due centimetri cubici. Posizionare una piastra di Petri contenente un'ansa con uno strato cellulare monolayer ferito. Sul palco di osservazione, arretrare il microscopio.
Spostare in avanti il supporto fino alla posizione verticale, in modo che il condensatore si allinei con l'ago per entrare nel liquido. Questa operazione deve essere eseguita con attenzione per evitare che l'ago si rompa sul vetrino coprioggetto. Utilizzando l'obiettivo 10x, identificare il centro dell'incrocio delle spirali e posizionare l'ago sopra le cellule da iniettare.
Aumentare l'ingrandimento passando all'obiettivo 40 x. Quindi abbassare e centrare l'ago utilizzando le manopole di regolazione fine del joystick. Iniziare l'iniezione in un angolo dell'incrocio della ferita abbassando l'ago fino al contatto con il nucleo.
Dopo l'iniezione, una cellula presenta un evidente cambiamento nella luminosità di fase. Proseguire lungo un margine della ferita trasversale. Per facilitare l'identificazione delle cellule iniettate durante la visualizzazione, è fondamentale regolare correttamente la pressione di iniezione per ogni ago.
La pressione deve essere sufficientemente elevata da perforare le membrane plasmatica e nucleare, ma non così elevata da uccidere le cellule. Microiniettare le cellule lungo il margine della ferita per un periodo di tempo fisso. Con la pratica, è possibile iniettare diverse centinaia di cellule durante questo intervallo.
Se si inietta DNA plasmidico, incubare le cellule microiniettate a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari per 20 minuti prima della fissazione, quindi arrestare la trascrizione. Trattare le cellule con un microgrammo per millilitro di alfa-amanitina disciolta nel mezzo di crescita. Questa concentrazione inibisce efficacemente la trascrizione dai plasmidi microiniettati.
Rimettere le cellule nell'incubatore e lasciare che esprimano l'mRNA appena sintetizzato. Un singolo ago può essere riutilizzato per iniettare più lamelle. Tuttavia, l'ago deve essere sostituito quando cambia il tipo di DNA o RNA che viene microiniettato.
Inoltre, una volta rimosso l'ago dalla bacchetta, quest'ultimo deve essere smaltito per ottenere una misurazione accurata della cinetica di esportazione nucleare dell'mRNA. Campioni separati devono essere fissati a zero minuti, 15 minuti, 30 minuti, 60 minuti e 120 minuti. Dopo il trattamento con alpha manin al tempo appropriato, aspirare il mezzo di crescita e lavare le cellule due volte con due millilitri di soluzione PBS.
È importante mantenere umide le lamelle riducendo al minimo il tempo in cui non sono immerse in liquido. Fissare le cellule aggiungendo due millilitri di aldeide al 4% in PBS e incubare le cellule per almeno 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i campioni fissati altre due volte, rendere le cellule permeabili con due millilitri di Triton X-100 allo 0,1% in PBS, quindi incubare nuovamente le cellule per almeno 15 minuti a temperatura ambiente.
Infine, lavare i campioni altre due volte per prepararli per l'ibridazione. Lavare le cellule due volte con un buffer di lavaggio costituito da una soluzione XSSC 1X contenente dal 25 al 60% di formammide. Quindi preparare la camera di colorazione per l'ibridazione coprendo il fondo di una piastra di Petri da 150 millimetri con acqua e facendo galleggiare sulla superficie un pezzo di paraformaldeide.
Rimuovere l'acqua capovolgendo la piastra, in modo da far aderire il paraform al fondo della piastra stessa. Rimuovere manualmente eventuali bolle d'aria da ogni coprioggetto da colorare. Pipettare gocce da 100 microlitri di soluzione di ibridazione sul paraform.
Si noti che la quantità di formaggio deve essere ottimizzata per il particolare pro di pesce in uso, con l'aiuto di pinzette. Rimuovere un'immersione con le cellule fissate dalla piastra di Petri da 30 millimetri. Utilizzando carta da filtro Watman, asciugare la parte posteriore dell'immersione ed eliminare il tampone in eccesso dal lato anteriore senza asciugare le cellule.
Quindi posizionare il coprivetrino con la faccia rivolta verso il basso sulla soluzione contenente il pesce. Ripetere questo procedimento per ogni coprivetrino. Dopo aver rimesso il coperchio sulle camere di colorazione, incubare i campioni per cinque fino a diciotto ore a 37 gradi Celsius.
Preparare diverse camere di lavaggio nello stesso modo in cui è stata preparata la camera di colorazione; per ogni coprioggetto, pipettare un millilitro di tampone di lavaggio sulla paraform della camera di lavaggio. Dopo l'incubazione, rimuovere i coprioggetti dalla camera di colorazione pipettando un millilitro di tampone di lavaggio. Accanto al coprioggetto, il liquido deve essere aspirato sotto ciascun campione per azione capillare.
Quindi rimuovere le lamelle con pinzette e posizionarle ciascuna su una goccia di buffer di lavaggio incubata a temperatura ambiente per cinque minuti. Lavare ogni lamella altre due volte, per un totale di tre lavaggi per ogni lamella. Pipettare da 10 a 30 microlitri di soluzione di montaggio con dappy su un vetrino precedentemente lavato. Ogni vetrino può ospitare due lamelle utilizzando pinzette e carta filtro Watman.
Asciugare il retro dei coprioggetti ed eliminare il liquido in eccesso dal lato anteriore del coprioggetto senza asciugare i campioni. Posizionare ogni coprioggetto con la faccia verso il basso su una goccia di soluzione di montaggio. I campioni montati possono essere conservati a quattro gradi Celsius.
Qui gli effetti dell'alpha mantin sulla trascrizione del DNA plasmidico iniettato sono stati mostrati in cellule di fibroblasti NIH 3T3, precedentemente trattate con concentrazioni variabili di alpha mantin. Sono state iniettate con TFL s delta i, DNA plasmidico e OG coniugato con dextran da 70 chilodalton. Ogni riga corrisponde a un singolo campo visivo acquisito per il dextran da 70 chilodalton OG e per l'mRNA di T uts delta I.
È evidente che alte concentrazioni del farmaco hanno completamente inibito la produzione del trascritto T UTS delta I, mentre questo effetto non è stato osservato a concentrazioni più basse. Riportato qui è un andamento temporale del costo dell'esportazione nucleare dell'mRNA. Sette cellule sono state iniettate con DNA plasmidico T UTS delta i e destrano coniugato con OG di 70 chilodalton.
30 minuti dopo l'iniezione, le cellule sono state trattate con alfa mantina e incubate a 37 gradi Celsius per zero minuti, 60 minuti e 120 minuti. Le cellule sono quindi state fissate e colorate con una sonda contro l'mRNA di T UTS delta I e con anticorpi contro il marcatore del reticolo endoplasmatico trap alfa; ogni riga corrisponde a un singolo campo di cellule.
Per informazioni su come quantificare l'esportazione di mRNA, si prega di consultare il testo online qui. Il punto temporale di 120 minuti è stato ingrandito per dimostrare la colocalizzazione dell'mRNA di TFS delta I nel reticolo endoplasmatico; viene mostrata una sovrapposizione dell'mRNA di T UTS delta I in verde e della TRAP alfa in rosso. Informazioni su come effettuare la colorazione simultanea di mRNA con proteine sono disponibili nel testo online.
Abbiamo appena mostrato come misurare la cinetica dell'esportazione nucleare dell'mRNA mediante microiniezione. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che una microiniezione di successo richiede una preparazione adeguata. Passaggi fondamentali come la preparazione del DNA e dell'RNA, la preparazione del campione, la fabbricazione degli aghi, l'allineamento dell'apparecchiatura ottica e la risoluzione dei problemi di microiniezione sono descritti nel nostro protocollo scritto.
Quando si esegue l'imaging e l'analisi di mRNA microiniettato, è fondamentale che la quantificazione sia limitata alle cellule che hanno ricevuto oltre il 90% del liquido iniettato nel nucleo. Una microiniezione nucleare di successo può essere valutata osservando la distribuzione della destrana verde organica nel nucleo e nel citoplasma. Si rimanda al nostro protocollo online per ulteriori informazioni sulla progettazione delle sonde per pesci e sull'uso di software di analisi delle immagini per studiare la distribuzione dell'mRNA nel citoplasma e nel nucleo.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo articolo descrive un procedimento che combina microiniezione e ibridazione fluorescente in situ per misurare la cinetica dell'esportazione nucleare dell'mRNA in cellule di mammifero. Il metodo consente una quantificazione precisa del movimento dell'mRNA dal nucleo al citoplasma.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Biologia molecolare
Sfondo
- Comprendere l'esportazione dell'mRNA è fondamentale per la funzione cellulare.
- La microiniezione consente una manipolazione diretta dei componenti cellulari.
- L'ibridazione fluorescente in situ fornisce un metodo visivo per tracciare l'mRNA.
- Studi precedenti hanno stabilito l'importanza del posizionamento dell'mRNA nell'espressione genica.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio affidabile per misurare la cinetica dell'esportazione dell'mRNA.
- Studiare la dinamica del movimento dell'mRNA nelle cellule di mammifero.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di regolazione post-trascrizionale.
Metodi Utilizzati
- Microiniezione di mRNA o DNA nei nuclei delle cellule di mammifero.
- Ibridazione fluorescente in situ per la colorazione dell'mRNA.
- Quantificazione della fluorescenza nel citoplasma e nel nucleo.
- Analisi temporale per misurare la cinetica di esportazione a diversi intervalli di tempo.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita della dinamica dell'esportazione dell'mRNA.
- Dati quantitativi sulla velocità di esportazione dell'mRNA dal nucleo.
- Identificazione delle condizioni ottimali per microiniezione e colorazione.
- Informazioni sui meccanismi regolatori del trasporto dell'mRNA.
Conclusioni
- L'uso combinato di microiniezione e tecniche fluorescenti è efficace per lo studio della cinetica dell'mRNA.
- Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di cellule mammifere.
- Ulteriori ricerche possono esplorare le implicazioni dell'esportazione dell'mRNA nei processi cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La misurazione della cinetica di esportazione nucleare dell'mRNA nelle cellule di mammifero fornisce informazioni fondamentali sulla regolazione post-trascrizionale, un fattore chiave nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico per i farmaci basati sull'RNA. Questo saggio di FISH con microiniezione consente una valutazione quantitativa e risolta nel tempo del traffico dell'mRNA, supportando una maggiore affidabilità predittiva nell'identificazione dei candidati promettenti e nella selezione dei modelli preclinici. Il metodo colma una lacuna nella misurazione diretta della cinetica nei sistemi di mammifero, migliorando la continuità traslazionale dalla fase di scoperta allo sviluppo preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando i tassi di esportazione dell'mRNA, chiarendo se siano i processi di maturazione dell'RNA o elementi specifici della sequenza a regolare l'accesso al citoplasma.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli collegando l'efficienza dell'esportazione nucleare all'output traduttivo in sistemi rilevanti per la patologia.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli identificando gli mRNA i cui parametri cinetici di esportazione si correlano ai livelli di espressione proteica, riducendo l'ambiguità meccanicistica.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo le cinetiche di base dell'esportazione di mRNA in condizioni controllate.
- Risultati quantitativi: Genera rapporti nucleo/citoplasma basati sulla fluorescenza in punti temporali definiti, consentendo la standardizzazione e la riproducibilità tra diverse campagne di screening.
- Riutilizzo della piattaforma: Permette una valutazione scalabile di modifiche dell'RNA o di costrutti chimera fornendo un output cinetico riutilizzabile per studi su composti o perturbazioni genetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Collega la dinamica dell'esportazione dell'mRNA all'allineamento dei biomarcatori traduzionali correlando le velocità di esportazione alla localizzazione subcellulare in condizioni patologiche.
- Continuità preclinica: Collega la fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo dati cinetici che guidano decisioni di avanzamento ponderate sul rischio per le modalità di intervento sull'RNA.
- De-risking meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo di de-risking quando la cinetica dell'esportazione rivela una dipendenza dallo splicing o requisiti specifici della sequenza, fornendo indicazioni per l'ottimizzazione del costrutto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi delle ipotesi all'identificazione dei candidati fino al lavoro preclinico, sostenendo un'affinamento iterativo dei candidati basati sull'RNA in base alla cinetica di esportazione.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi misurando come le perturbazioni influenzano i tassi di esportazione nucleare dell'mRNA in cellule di mammifero.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso letture quantitative di fluorescenza che permettono il confronto di varianti di mRNA in condizioni standardizzate.
- Analisi: Evidenzia la quantificazione della fluorescenza nucleare/citoplasmatica come parametro chiave per valutare l'efficienza di esportazione e confrontare le condizioni sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica fornendo dati cinetici coerenti con studi di biomarcatori traslazionali in modelli di malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per valutare costrutti di RNA in diversi progetti, riducendo lo sviluppo ridondante di saggi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei percorsi di elaborazione dell'RNA.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle misurazioni cinetiche tra linee cellulari e condizioni sperimentali.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di terapie a base di RNA.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate sulla cinetica di esportazione correlata agli esiti funzionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di microiniezione e nei protocolli di ibridazione fluorescente in situ.
- Richiede strumentazione specifica, tra cui microscopi invertiti dotati di microiniettori e sistemi di imaging a fluorescenza.
- Necessita di una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire protocolli coerenti di preparazione dei campioni, fissazione e acquisizione delle immagini.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diverse linee cellulari di mammifero, per tenere conto della variabilità nei meccanismi di esportazione nucleare.
- Presenta limitazioni pratiche, come la variabilità tecnica nell'efficienza di iniezione e la necessità di ottimizzare le condizioni di ibridazione delle sonde.
