Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

Ciao, mi chiamo Ken Paradiso. Lavoro per Ling Gang Wu presso il programma intramurale dell'Istituto Nazionale dei Disturbi Neurologici e dell'Accidenti Cerebrovascolari, situato presso il NIH nel campus di Bethesda. Vi mostrerò le tecniche per la registrazione presinaptica con blocco del potenziale d'azione mediante patch-clamp.

Per preparare il tessuto cerebrale, rimuoviamo il cervello dal ratto. Poniamo il cervello all'interno di questa soluzione, che deve essere fredda con ghiaccio e a basso contenuto di calcio, e la saturiamo con carbogeno per garantire un costante apporto di ossigeno al cervello. Inoltre, la soluzione deve essere mantenuta fredda con ghiaccio per minimizzare il DA, riducendo al minimo il danno subito.

Il cervello si troverebbe ora in questa soluzione. Lo si estrae, lo si taglia in modo appropriato in modo da poterlo posizionare sul blocco, fissandolo al blocco con Sano correlate o colla istantanea, quindi si riempie la camera con una soluzione fredda di ghiaccio a basso contenuto di calcio, la si ossigena, la si posiziona sul vibratome e successivamente si tagliano sezioni di spessore compreso tra 180 e 190 micron, con una frequenza della lama di 70 hertz e una velocità di avanzamento di 0,01-0,02 millimetri al secondo. Ciò corrisponderebbe a 10-20 micron al secondo.

Dopo aver effettuato ciascun taglio, trasferiamo le sezioni dalla soluzione salina ghiacciata a questa camera, che contiene una soluzione con concentrazione normale di calcio. Questa è la stessa soluzione in cui effettuiamo le registrazioni ed è mantenuta a 37 gradi, temperatura fisiologica. Successivamente, inseriamo le sezioni qui dentro per il recupero.

Rimane qui dentro per mezz'ora fino a un'ora prima di eseguire gli esperimenti di fisiologia. Quindi ora prendo il cervello e lo estraggo dalla soluzione. Questo è un cervello di dimensioni maggiori, utilizzato a scopo dimostrativo.

Questo proviene da un ratto P20. Lo gireremo. È il bulbo allungato che ci interessa.

Quindi questa zona qui in basso e il calice si trovano proprio in quell'area lì. Quello che faremo è rimuovere il resto del cervello, isolare il tronco encefalico e quindi preparare il tronco encefalico per la camera di taglio. Ok, quindi taglieremo via il resto del cervello, isolando soltanto il tronco encefalico.

Lo girerò per dimostrare la posizione attuale. Normalmente non procederemmo in questo modo e, ancora una volta, possiamo semplicemente eliminare tutta quella parte. Rigirotandolo, abbiamo isolato il tronco encefalico e stiamo per eseguire un altro taglio proprio lì.

Bene, questo è il tronco encefalico. La calotta di Held è proprio qui e qui.

Questo è il tronco encefalico. Ancora una volta, lo spingeremo leggermente all'indietro. Taglieremo via un lato del cervelletto e questo permetterà al tronco encefalico di disporsi lateralmente in questo modo.

Abbiamo aggiunto una piccola quantità di colla acrilica Sano e, mantenendola in posizione laterale, l'abbiamo riempita rapidamente con ghiaccio freddo e soluzione fredda a basso contenuto di calcio. Inseriamo subito la linea di ossigeno. Ora la prendiamo e la portiamo al vibratome.

Lo introduciamo rapidamente per raggiungere l'inizio del cervello, e una volta giunti all'inizio del cervello, riduciamo la velocità a 0,01 millimetri al secondo. Quindi si tratta di 10 micrometri al secondo. Si muove quindi a un ritmo incredibilmente lento.

La prima porzione del cervello è la parte che contiene il mtb, ovvero il nucleo mediale del corpo trapezoide. E questa è la parte che contiene, bene, quindi una volta che l'ho nella pipetta di trasferimento, cerco di avvicinarla il più possibile alla punta della pipetta. E c'è la sezione del cervello che trasferisco piuttosto rapidamente in questa camera, che contiene una soluzione standard per la registrazione con livelli normali di calcio e anche una temperatura più elevata.

E ciò permetterà alle fette di riprendersi dopo le procedure di taglio, in modo che siano pronte per esperimenti di fisiologia. Ok, da questo momento in poi sarà sempre la stessa cosa. L'equipaggiamento seguente è quello che userò per effettuare il patch clamping.

Abbiamo un microscopio verticale con piatto fisso. Il piatto, come detto, è fissato, quindi il microscopio si muove al di sotto di esso tramite un manipolatore. Utilizziamo un micro-manipolatore Wigs e Newman per sostenere il piatto, la testa del piatto dell'amplificatore, e impieghiamo un amplificatore per clampaggio con patch EPC 10 di HECA.

E ciò che avrei anche dovuto menzionare è che utilizziamo la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) con luce infrarossa. Abbiamo quindi una telecamera a infrarossi qui, e tutto ciò che vediamo apparirà sullo schermo quando stiamo cercando le CAE. L'amplificatore per il patch clamp è controllato da questo software, chiamato Pulse, anch'esso prodotto da Heca, che controlla l'amplificatore e l'intero esperimento di fisiologia.

I risultati verranno visualizzati su questo schermo. Il calice in cui si è effettuato il blocco è un terminale presinaptico di grandi dimensioni e, poiché è ampio, ci permette di effettuare fisicamente un'incubazione sul terminale. In questo modo possiamo ottenere registrazioni presinaptiche, una caratteristica piuttosto unica, specialmente nel sistema nervoso centrale.

Questo ci permette di misurare i canali del calcio attivati in modo presinaptico. Inoltre, possiamo anche misurare l'attività del potenziale d'azione, se volessimo stimolare il nervo che porta alla calotta. Quello che facciamo in questo laboratorio è misurare un processo chiamato esocitosi, ovvero la fusione delle vescicole contenenti neurotrasmettitore con la membrana.

Ora, quando queste vescicole si fondono con la membrana nel processo chiamato esocitosi, aggiungono membrana al terminale sinaptico, e possiamo misurare questo fenomeno come un cambiamento nella capacità elettrica. Osserveremo un aumento della capacità quando la membrana viene aggiunta al terminale; quindi, gli esperimenti che mostrerò oggi sono misurazioni della capacità elettrica a livello presinaptico durante la rimozione della membrana. Pertanto, non si può continuare ad aggiungere membrana indefinitamente, ma è necessario ovviamente rimuoverne una parte.

Questo processo è chiamato endocitosi o assorbimento della membrana. Possiamo misurare anche questo fenomeno, che verrà rilevato come una diminuzione del livello di capacità elettrica; mostreremo esempi a riguardo più avanti. Ciò che ciò ci consente di fare è monitorare l'attività dei canali del calcio e allo stesso tempo osservare alcune delle proteine coinvolte nell'esocitosi e nell'endocitosi, per poterle studiare.

È possibile inserire peptidi per bloccare le proteine coinvolte nell'esocitosi o nell'endocitosi. Possiamo inoltre utilizzare tossine che svolgono la stessa funzione. Possiamo anche regolare le quantità di calcio che entrano nel terminale, permettendoci di studiare in modo approfondito il processo di esocitosi, il rilascio del neurotrasmettitore, nonché l'assorbimento della membrana che segue tale evento.

Questo è il tubo contenente la nostra soluzione per la registrazione intracellulare. La prepariamo in anticipo, quindi la congeliamo e di solito possiamo utilizzarla per diverse settimane fino a un mese prima di doverne preparare di nuova. Ancora una volta, pensavamo immediatamente prima di effettuare le registrazioni, e si finisce sempre per raccogliere una certa quantità di particelle di polvere o altri tipi di detriti che entrano nel tubo.

È possibile fare una tra due cose. Si può prelevare la soluzione e filtrarla, oppure centrifugarla per uno o due minuti e quindi asportare la soluzione, lasciando una porzione inferiore contenente detriti e altri materiali. Preferisco quindi la centrifugazione e la eseguirò subito.

Questo è quindi il tubo contenente la nostra soluzione intracellulare. È stato scongelato. Lo centrifugheremo per circa due o tre minuti in una piccola centrifuga, il che dovrebbe essere sufficiente per rimuovere eventuali particelle di polvere di grandi dimensioni dalla soluzione.

Ora rimuovo semplicemente la parte superiore, la soluzione che abbiamo appena centrifugato, avendo cura di non agitarla, trasferendola in una provetta pulita, e ne prelevo circa il 90%. Cerco di nuovo di non prendere quell'ultima piccola quantità. Quindi mi fermo proprio qui.

Ho messo subito questo sul ghiaccio in modo che rimanga bello freddo durante l'esperimento. Questo è molto importante. Questa è, questa è una delle nostre pipette.

Utilizziamo questo per le registrazioni intracellulari. È un vetro di silice con pareti spesse e foro interno, con un diametro esterno di due millimetri e un diametro interno di 1,16 millimetri. Per prima cosa, procediamo a riempire posteriormente la pipetta.

Quindi applichiamo una depressione, immergiamo la pipetta nella soluzione di registrazione e applichiamo una depressione per cercare di riempire l'estremità molto, molto fine della pipetta, che altrimenti non si riempirebbe in nessun altro modo. Una volta fatto ciò, prendiamo un tubo capillare e riempiamo il resto dell'elettrodo attraverso la parte posteriore della pipetta. Questa è una tecnica standard in fisiologia e consiste letteralmente nel dare un colpetto secco.

C'è il rischio di rompere la punta della pipetta, ma si avranno comunque bolle d'aria se non lo si fa. Ok, ora la posizioniamo sul supporto della pipetta, che è collegato allo stadio di testa dell'amplificatore patch-clamp. C'è un filo di cloruro d'argento.

Il filo di cloruro d'argento entra in contatto con la soluzione intracellulare, e ciò ci permette di misurare l'attività elettrica nel terminale presinaptico. Quindi, quello che facciamo è trovare la sezione che contiene un elevato numero di CAEs. Desideriamo un'alta densità di CAEs.

Quindi, stiamo cercando il nucleo mediale del corpo trapezoide, ovvero il MNTB, dove si trova la terminazione che forma la calice sostenuta, o meglio la calice, in cui si osserva tale struttura. Pertanto, iniziamo a scansionare attraverso la sezione. Ad esempio, qui abbiamo una calice leggermente al di sotto della superficie e non c'è molto su cui effettuare il patch, quindi continuiamo semplicemente a scansionare lateralmente.

Quindi questa è una calice qui che stiamo cercando. Ho fatto due segni sullo schermo, che indicano dove andrà la pipetta. E potete vedere che c'è il pezzo di calice che andrò a prelevare; la pipetta scenderà.

Applicherò una pressione positiva in modo che spinga verso l'alto contro il calice, quindi ridurrò la pressione positiva. Il calice spingerà allora contro la pipetta e, a quel punto, applicherò un'aspirazione molto delicata cercando di aspirare e spingere la membrana oppure di far aderire la membrana alla punta della pipetta. Bene, ho ridotto la pressione positiva.

E ora applicherò l'aspirazione. Quindi qui siamo in modalità pro, applichiamo un impulso di cinque millivolt, o per essere precisi di quattro millivolt. Okay, fatto. Okay.

Ora abbassiamo il potenziale di membrana a meno 80 e annulliamo il picco transitorio rapido. Ora passeremo alla configurazione whole cell. Applicherò una leggera aspirazione e cercherò di ottenere la rottura della membrana.

Quei transitori di carica indicano che, che la pipetta e la cellula ora sono continue, che si è ottenuta una registrazione stabile. È un altro ottimo risultato. La linea rossa più chiara rappresentava la traccia della capacità, e si può osservare un brusco aumento seguito da un calo.

Ok, ti ho appena mostrato le tecniche di base per ottenere registrazioni da un terminale presinaptico a calice mantenuto. Ti ho mostrato come produrre sezioni che contengono il nucleo mediale del corpo trapezoide. È lì che troverai i calici mantenuti.

E ti ho mostrato le tecniche per esaminare le sezioni. Dovrai esaminare ciascuna sezione, cercando quella che presenta il maggior numero di cali presenti sulla superficie. Successivamente, dovrai cercare la membrana del calo più grande che riesci a trovare ed effettuare una registrazione mediante patch clamp su di essa.

E ho anche mostrato le tecniche per la registrazione con patch clamp, e queste sono tecniche standard di registrazione con patch clamp.