Valutazione della migrazione delle cellule staminali del cancro mediante compartimentazione dispositivi microfluidici e Live Cell Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è ispezionare visivamente e caratterizzare la migrazione delle cellule tumorali attraverso un dispositivo microfluidico compartimentato. Questo viene realizzato innanzitutto dissociando neurosfere preesistenti di cellule staminali tumorali cerebrali coltivate in mezzo privo di siero. Il secondo passaggio consiste nel realizzare un master in SU-8 bilayer e nell'utilizzare uno stampo in PDMS ottenuto mediante litografia morbida, che presenta un disegno compartimentato.

Successivamente, assemblare il dispositivo microfluidico e caricarlo con cellule staminali tumorali cerebrali. Infine, l'acquisizione di immagini in time-lapse a lungo termine della migrazione delle cellule staminali tumorali cerebrali viene effettuata utilizzando un sistema microscopico tutto in uno. In definitiva, i risultati mostrano che le cellule staminali tumorali cerebrali esibiscono una sequenza rotante di stadi morfologici durante la loro migrazione attraverso spazi ultra-confinati.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a sistemi esistenti come la camera Transwell Boyton è che il microdispositivo consente un'ispezione visiva del processo di migrazione, un posizionamento controllato delle cellule e un rilascio preciso di fattori. Pertanto, la tecnologia microforica presenta caratteristiche di selezione e navigazione cellulare singola affidabili, efficienti ed economiche. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della metastasi e della recidiva del cancro, poiché l'analisi di cellule singole altamente migratorie potrebbe identificare potenziali bersagli futuri per la chemioterapia.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul comportamento migratorio del sistema tumorale, può essere applicato anche ad altri sistemi come lo sviluppo embrionale, le risposte immunitarie, la guarigione delle ferite e la rigenerazione degli organi. Iniziare con la sospensione cellulare di neurosfere derivate da BTSC. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugarle a 900 giri/min per cinque minuti, ma non più velocemente.

Aspirare il soprannatante. Quindi lasciare che le neurosfere si sciolgano incubandole in 0,5 millilitri di Accutase preriscaldato per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, dissociare meccanicamente le cellule eseguendo 10-20 movimenti delicati con una pipetta P100.

Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo per cellule staminali per neutralizzare l'Accutase, centrifugare la sospensione cellulare a 1300 g per cinque minuti e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo per cellule staminali. Verificare la densità cellulare mediante emocitometro e regolare la densità a 20.000 cellule per microlitro. Per iniziare la fabbricazione del master SU-8, preparare due maschere fotolitografiche utilizzando Adobe Illustrator e stampando su pellicola trasparente con Image Setter integrato.

La maschera fotolitografica del primo strato comprende due marcatori fiduciali e un reticolo di microcanali, mentre il secondo strato della maschera fotolitografica presenta le camere di alloggiamento e di raccolta. Pulire entrambi gli strati della maschera con isopropanolo e lasciarli asciugare all'aria. Procedere quindi con la deposizione mediante spin coating di un wafer di supporto con un resist fotochemico SU-8 spesso tre micron, seguita da una cottura leggera.

Quindi, con la prima maschera fotolitografica a contatto ravvicinato con raggi UV, esporre il fotoresist e lasciarlo polimerizzare. Successivamente, effettuare la cottura post-esposizione e sviluppare la pastiglia polimerizzata. Coprire le aree dei marcatori fiduciali della pastiglia di supporto con nastro adesivo trasparente.

Quindi, applicare il photoresist sul wafer con uno spessore di 250 micron mediante spin coating. Successivamente, rimuovere il nastro per esporre i marcatori utilizzati per l'allineamento. Applicare il secondo strato di photoresist e allineare i marcatori fiduciali.

Quindi esporre e polimerizzare con UV il secondo strato della fotomaschera, seguito da cottura post-esposizione e sviluppo. Ora rendere idrofobo il master in SU-8 mediante deposizione da vapore per ridurre l'adesività superficiale. Posizionare le wafer in un desiccante con alcune gocce di soluzione di triclorosilano sotto vuoto per almeno un'ora.

Il master sarà quindi pronto per essere utilizzato per la stampatura del PDMS. Iniziare mescolando accuratamente la base del prepolymer con il curante in un rapporto di 10 a 1. Successivamente, collocare la miscela in un essiccatore sotto vuoto per la degasificazione, fino a quando non si vedranno più bolle d'aria.

Versare la miscela sulla maschera e sottoporla nuovamente a degasaggio. Se vengono introdute nuove bolle d'aria, polimerizzare il calco su una piastra riscaldante livellata per due ore a 90 gradi Celsius. Dopo che si sarà raffreddato a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente il timbro in PDMS.

Pertanto, i canali per la coltura sono incisi nel PDMS e pronti per l'assemblaggio del dispositivo microfluidico. Il master può essere riutilizzato per la stampatura fino a quando non si rompe o si usura. Quando il master diventa appiccicoso, il rivestimento antiadesivo può essere riapplicato.

Cominciare creando ingressi e uscite nel dispositivo microfluidico attraverso il timbro in PDMS. Utilizzando una punta da biopsia, pulire il timbro in PDMS immergendolo in etanolo al 70% per 30 minuti, quindi risciacquandolo con acqua deionizzata per 10 minuti. Sterilizzare e completare le reazioni di reticolazione del timbro in PDMS mediante autoclavaggio.

Ora posizionare il timbro in PDMS su un coprioggetto di vetro rivestito con poli-L-lisina. Il dispositivo viene quindi rivestito con laminina riempiendo le camere con soluzione di laminina attraverso gli ingressi dei serbatoi e incubato tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare la laminina dal dispositivo.

Quindi lavare il dispositivo inondandolo due volte con mezzo per cellule staminali. Ora caricare 11 microlitri di cellule dissociate in uno dei serbatoi di semina. Se necessario, utilizzare l'aspirazione a vuoto per far entrare le cellule nella camera. Successivamente, caricare ulteriori sette microlitri di cellule nel serbatoio di adesione adiacente.

Dopo cinque minuti, le camere di seduta e di ricezione saranno piene di mezzo. Posizionare ora un foglio sterile di PDMS dello spessore compreso tra 0,5 e 1 millimetro sul dispositivo. L'adesione superficiale naturale del PDMS con se stesso sigillerà il dispositivo; una volta sigillato, sarà pronto per il trasporto, l'incubazione e l'analisi microscopica.

Pre-equilibrare il biot, IM eseguendolo per 45 minuti. Per stabilizzare la temperatura, l'umidità e l'alimentazione d'aria, aggiungere diverse capsule di Petri contenenti acqua alla camera del campione per ottenere l'umidità appropriata. Caricare il dispositivo preparato nella camera del campione del microscopio.

Centrare il dispositivo utilizzando pinzette microscopiche. Impostare ora i punti di messa a fuoco e i punti temporali utilizzando il software Biot e avviare le registrazioni con lapse temporale, se necessario. Dopo cinque giorni di coltura, sostituire il mezzo di coltura.

I BTC seminati nel dispositivo sono stati registrati continuamente mediante immagine in contrasto di fase. Per cinque giorni nella camera di adesione, le cellule di forma fusiforme sono rimaste nella fase pre-migrazione. Mentre si avvicinavano all'ingresso del microcanale, alcune cellule si sono espanse e hanno generato protrusioni adesive.

Solo una cellula è stata in grado di occupare l'ingresso ed esplorare la direzione della migrazione. Una volta determinata la direzione della migrazione, la cellula ha proseguito attraversando l'intero microcanale a velocità costantemente elevata. Alla fine del microcanale, la cellula ha continuato a esplorare lo spazio aperto della camera ricevente prima di entrare definitivamente al suo interno.

Osservando le cellule con intervalli di acquisizione di due secondi, la potenza migratoria sembrava essere generata principalmente da un'attività di protrusione simile a quella delle cellule OID. Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordare che il design del dispositivo è così flessibile che le dimensioni dei microcanali possono essere modificate per ottenere un grado desiderato di migrazione cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare un dispositivo microfluidico compartimentalizzato unico, adatto per la coltura delle cellule di interesse, e quindi eseguire un'acquisizione temporale a lungo termine per definire in modo qualitativo e quantitativo le caratteristiche migratorie di queste cellule seguendo questa procedura.

Altri metodi come il sequenziamento di nuova generazione o il DNA microarray possono essere applicati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quanto siano geneticamente diversi le cellule tumorali altamente migratorie.