Clonogenica saggio: cellule aderenti

Ciao, mi chiamo Lum e attualmente sto svolgendo il mio dottorato presso l'istituto BE IDI Heart and Diabetes Institute sotto la supervisione del dott. Tom Carianne, responsabile del Laboratorio di Medicina Epigenomica. In questo video, illustrerò la procedura nota come Clonogenic Survival Assay. Si tratta di una tecnica di 50 anni, che consente di valutare l'impatto di diversi trattamenti, come l'esposizione a radiazioni o agenti chimici, sulla vitalità riproduttiva cellulare.

L'assay di sopravvivenza congeneico è una tecnica fondamentale nella biologia della radiazione per valutare la sensibilità radiante di diverse linee cellulari e testare l'efficacia di diversi composti radio-protettivi o radio-sensibilizzanti. Quando si utilizza una linea cellulare aderente, l'assay di sopravvivenza criogenico si compone di tre fasi. Primo, il trattamento di un monostrato di cellule aderenti.

In secondo luogo, la preparazione di una sospensione di singole cellule e la semina di un numero noto di cellule in piastre trattate, e in terzo luogo, la colorazione, il conteggio e le colonie formate dopo un periodo di incubazione. In questo video, utilizzerò cellule immortalizzate di cino site umane per dimostrare come il saggio poligenico Bible possa essere impiegato per determinare le proprietà radio protettive dell'antiossidante naturale. 1225 provette vengono seminate con cellule in cinque millilitri di mezzo in anticipo, in modo che nel giorno dell'esperimento vi sia 1 milione di cellule per provetta.

50 microlitri del farmaco vengono aggiunti a diverse concentrazioni ai cinque millilitri di terreno in ciascun matraccio opportunamente etichettato per raggiungere la concentrazione richiesta; vengono utilizzate cinque concentrazioni, oltre a un controllo con veicolo, in questo caso PBS. Dopo l'aggiunta del farmaco, le cellule vengono incubate per un'ora nelle condizioni appropriate per la linea cellulare utilizzata. Successivamente all'incubazione, i campioni, escluso il gruppo di controllo, vengono irradiati alla dose scelta, che in questo caso è di quattro gray prodotti da una sorgente di cesio emittente di raggi gamma.

Dopo l'irradiazione, i mezzi vengono versati via e ogni fiala viene lavata con due millilitri di PBS per cinque minuti. Dopo aver eliminato il PBS, vengono aggiunti due millilitri di tripsina allo 0,05% in ogni fiala per staccare le cellule aderenti A dalla fiala. Successivamente, vengono aggiunti cinque millilitri inferiori di DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino in ogni fiala per inattivare la tripsina.

I contenuti completi del fasc vengono quindi trasferiti in provette falcon da 10 millilitri etichettate. Al termine, queste provette vengono centrifugate per cinque minuti, dopo di che il sopranatante viene scartato con attenzione senza disturbare il palletto, e vengono aggiunti cinque mililitri di mezzo crecy a ciascuna provetta. La concentrazione delle cellule per ogni campione viene calcolata ENC, così come il volume necessario di ciascun campione per ottenere una concentrazione finale di cellule da seminare in cinque piastre di Petri per campione, con cinque millilitri di mezzo ciascuna.

Ad esempio, per il gruppo di controllo, vengono seminate 100 cellule per piastra, quindi il volume necessario per ottenere 500 cellule ogni 25 millilitri viene calcolato; per campioni più concentrati, eseguire una diluizione 10 volte o una diluizione seriale 100 volte per minimizzare l'errore associato all'uso di volumi inferiori a 100 microlitri. Ora il volume precedentemente calcolato viene preparato in un tubo Falcon contenente 25 millilitri di terreno per ogni campione. I campioni possono ora essere trasferiti nelle piastre precedentemente etichettate, aggiungendo cinque millilitri per ogni piastra per facilitare la manipolazione e il trasporto.

Conservare le piastre in un contenitore grande, sterile o disinfettato. Le piastre vengono quindi posizionate in un incubatore umidificato nelle condizioni appropriate e incubate per otto giorni. Se si utilizzano cheratinociti dopo otto giorni, rimuovere con attenzione le piastre dall'incubatore e disporle una alla volta all'interno di una cappa chimica.

Maneggiare con cura la piastra in modo da non disturbare eventuali colonie formate. Rimuovere i coperchi e aggiungere cinque ml di soluzione salina allo 0,9% in ogni piastra per lavarle. Indirizzare la punta della pipetta verso l'angolo della piastra ed evitare di toccare il fondo in modo da non rimuovere accidentalmente le colonie.

Dopo cinque minuti, aspirare con attenzione la soluzione salina. Ora, le colonie vengono fissate con tre millilitri di 4%formula, e i tappi devono essere sostituiti per evitare l'evaporazione. Dopo da 15 minuti a mezz'ora, la formula viene aspirata e smaltita correttamente.

Le colonie sono ora pronte per essere colorate con violetto di cristallo allo 0,1%: vengono aggiunti cinque millilitri a ogni piastra e i coperchi vengono riposizionati dopo mezz'ora a un'ora. Il colorante viene quindi rimosso con acqua distillata e le piastre vengono capovolte e lasciate asciugare tutta la notte. Le colonie sono ora pronte per essere contate.

Le colonie possono essere contate manualmente utilizzando un microscopio stereoscopico. Qualsiasi aggregato di cellule contenente 50 o più cellule è considerato una colonia. Con questo si conclude la nostra dimostrazione del saggio di sopravvivenza congenico.

Il principale vantaggio di questo saggio rispetto ad altre tecniche è la sua estrema sensibilità, che consente di rilevare la sopravvivenza anche dopo una riduzione cellulare di sei ordini di grandezza. Questa sensibilità viene ottenuta seminando un numero maggiore di cellule. Questo saggio può essere facilmente utilizzato anche per altre finalità, ad esempio per valutare la citotossicità.

Grazie per aver guardato.