Preparazione, purificazione e caratterizzazione di complessi lantanidi per l'uso di agenti di contrasto per Risonanza Magnetica

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare, purificare e caratterizzare complessi contenenti lantanidi che possono essere utilizzati per etichettare macromolecole biologiche. Questo risultato si ottiene innanzitutto mescolando il materiale di partenza metallico e il ligando, controllando al contempo il pH della soluzione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel purificare il complesso ottenuto mediante dialisi.

Successivamente, è necessario verificare l'assenza di metallo libero. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella caratterizzazione delle proprietà del complesso rilevanti per l'imaging. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano come i complessi sintetizzati si comportino come agenti di contrasto mediante misurazioni dell'attività di rilassamento.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'imaging, ad esempio se il numero di coordinazione dell'acqua di un agente di contrasto cambia al legame con una proteina. In generale, chi necessita di questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché non controllare con attenzione il pH renderebbe l'LI inutile per l'educazione in ambito biologico. La dimostrazione delle misurazioni di dialisi e dell'attività sarà effettuata da Buda e Sashi.

Gli studenti laureati del mio laboratorio per iniziare la metilazione utilizzando sali di lantanidi devono prima sciogliere un equivalente di ligando in acqua per produrre una soluzione da 30 a 265 millimolari. Il ligando Paraiso Benzyl DTPA viene utilizzato qui a una concentrazione di 73 millimolari. Successivamente, regolare il pH della soluzione del ligando tra 5,5 e 7 aggiungendo idrossido di ammonio 1 molare.

In questo video, 0,2 millilitri di soluzione di idrossido di ammonio uno molare vengono utilizzati per sciogliere da uno a due equivalenti di cloruro di lantanide in acqua, producendo una soluzione con una concentrazione compresa tra 5 e 1000 millimolari. Può essere utilizzato cloruro di europio o cloruro di gadolinio a concentrazioni di 111 millimolari. Spesso si utilizza un eccesso di metallo per spingere la reazione a completamento e, di conseguenza, semplificare la purificazione.

Successivamente, aggiungere ogni soluzione di sali di lantanio alla soluzione preparata del ligando sotto costante agitazione. Ora regolare il pH delle miscele reazionarie risultanti tra 5,5 e sette aggiungendo idrossido di ammonio 0,2 molare. In questo caso, un volume totale di 0,5 millilitri della soluzione di idrossido di ammonio 0,2 molare viene utilizzato per regolare il pH della soluzione.

Se il ligando utilizzato contiene gruppi funzionali sensibili agli acidi, regolare il pH più volte durante questo passaggio. Prestare attenzione durante la regolazione del pH perché, se la soluzione diventa troppo basica, eventuali gruppi funzionali sensibili alle basi, come l'isotiocianato, diventeranno inutilizzabili. Per la coniugazione, monitorare attentamente la reazione mediante misurazioni del pH.

La reazione è completa quando il pH rimane costante. Per i ligandi privi di gruppi funzionali sensibili alla base, può essere utile una lavorazione che prevede l'aumento del pH. Per iniziare la lavorazione mediante dialisi, determinare la lunghezza appropriata del tubo da dialisi in modo da contenere il volume del campione più una lunghezza aggiuntiva pari al 10% in più rispetto al volume del campione. Successivamente, seguire le indicazioni del produttore per tagliare il tubo alla lunghezza desiderata.

In questo video è stata utilizzata una membrana con cutoff del peso molecolare compreso tra 100 e 500 Dalton, ma si può utilizzare un tubo con cutoff del peso molecolare più elevato, se appropriato, qualora la coniugazione venga eseguita prima della metilazione. Se necessario, in base alle indicazioni del produttore, immergere il tubo da dialisi tagliato in acqua per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, riempire un contenitore per dialisi con acqua, che fungerà da dializzato. In questo caso si utilizza un becher da un litro.

Il volume del dializzato dovrebbe essere circa 100 volte quello del campione. Ora piegare l'estremità del tubo due volte e fissare la parte piegata con la molletta di chiusura per dialisi. Avvolgere l'estremità della chiusura con un elastico per assicurarsi che rimanga chiusa durante la dialisi.

Filtrare la miscela di reazione preparata in precedenza attraverso un filtro da 0,2 micron. Successivamente, caricare il filtrato nell'estremità aperta del tubo, avendo cura di non strappare il tubo.

Assicurarsi di lasciare spazio sufficiente per chiudere il tubo. Pieghare due volte l'estremità aperta rimanente del tubo, quindi fissarla con un dispositivo di chiusura e avvolgere il dispositivo con un elastico. Successivamente, fissare una provetta di vetro contenente aria alla pinza su un'estremità del tubo di dialisi utilizzando un altro elastico.

Quindi fissare una provetta contenente sabbia all'altra pinza. Queste provette garantiscono che il tubo rimanga immerso nel dializzato. Ora, posizionare l'intero tubo nel serbatoio di dialisi che contiene il dializzato.

Mescolare il dializzato utilizzando una piastra magnetica a velocità lenta a temperatura ambiente. Assicurarsi che la velocità di agitazione rimanga lenta e che la soluzione non vortichi. Cambiare il dializzato tre volte nell'arco di un giorno.

In questo video, il dializzato viene sostituito a 2,5, 6,5 e 11,5 ore. Lasciare proseguire la dialisi per tutta la notte, per un totale di 20-28 ore. Al termine della dialisi, rimuovere il tubo dal dializzato e aprire con attenzione un'estremità chiusa per prelevare il campione.

Lavare il tubo da dialisi tre volte con acqua e unire i lavaggi al campione. Infine, rimuovere l'acqua dal campione sotto pressione ridotta. Questo viene effettuato mediante liofilizzazione.

Il campione viene congelato e quindi posizionato su un apparecchio per la liofilizzazione. Per valutare la presenza di metallo libero nel campione, preparare innanzitutto un tampone acetato sciogliendo 1,4 millilitri di acido acetico in 400 millilitri di acqua, quindi regolare il pH a 5,8 con idrossido di ammonio 1 M e aggiungere acqua fino a raggiungere un volume totale di 500 millilitri. Successivamente, sciogliere 0,3 milligrammi di ciascun complesso in 0,3 millilitri di tampone.

Ora preparare l'indicatore xol arancione, che deve essere 16 micromolare nel tampone a pH 5,8. Aggiungere tre millilitri di questa soluzione indicatrice ai complessi metallici precedentemente sciolti. Rilevare la presenza di metallo libero osservando il cambiamento di colore dell'indicatore da giallo a violetto.

Se lo si desidera, la quantità di metallo libero può essere quantificata creando una curva di calibrazione. Se rimane metallo libero, il campione deve essere ulteriormente purificato mediante dialisi o cromatografia liquida ad alte prestazioni prima della caratterizzazione. Successivamente, per determinare il numero di coordinazione dell'acqua in un campione di oppio, preparare una soluzione di circa un millimolare del complesso contenente oppio in acqua e quindi un'altra soluzione della stessa concentrazione in ossido di deuterio.

Prima dell'analisi, la soluzione di ossido di deuterio deve essere evaporata e sciolta nuovamente nell'ossido di deuterio per tre volte al fine di rimuovere l'acqua residua; accendere quindi lo spettrofluorimetro, aggiungere la soluzione acquosa in una vete pulita e posizionare la vete nello spettrofluorimetro. Eseguire ora l'eccitazione e le emissioni per determinare i massimi rispettivamente a circa 395 nanometri e 595 nanometri. Successivamente, effettuare un esperimento di decadimento temporale della fosforescenza utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appena determinate e i parametri mostrati qui.

Ripetere questo passaggio con una soluzione preparata di ossido di deuterio. Dai dati del decadimento della luminescenza appena ottenuti, tracciare il logaritmo naturale dell'intensità in funzione del tempo. Le pendenze di queste rette corrispondono alle velocità di decadimento. In questo video, Microsoft Excel 2007 è stato utilizzato per generare i grafici del logaritmo naturale a partire dai dati grezzi.

Utilizzare i tassi di decadimento nell'equazione sviluppata da Hors e colleghi mostrata qui. Se il ligando contiene gruppi OH o NH coordinati al metallo, allora l'equazione deve essere modificata prima dell'uso. Per determinare le misurazioni di rilassamento del campione, selezionare innanzitutto la modalità di applicazione desiderata sull'analizzatore dei tempi di rilassamento, T1 o T2.

Qui è selezionata l'impostazione T one. Successivamente, preparare una serie di campioni che contengono diverse concentrazioni del complesso contenente lantanide in un solvente acquoso. In questo caso, viene utilizzata acqua come solvente e soluzioni di dieci cinque due 0,5, 1,25, 0,625 e zero.

Vengono preparati millimolari. Possono essere utilizzati altri solventi o tamponi, ma è importante utilizzare il solvente come bianco. Il volume finale del campione è specifico per lo strumento che viene utilizzato.

Posizionare un campione nello strumento e lasciarlo riposare per cinque minuti per permettergli di equilibrarsi alla temperatura dello strumento, che è di 37 gradi Celsius per l'unità utilizzata in questo video. Determinare ora il tempo di rilassamento in unità di secondi regolando i parametri del software per ottenere una curva esponenziale liscia per T uno o T due. Ripetere questa procedura per tutti i campioni, inclusa la prova in bianco.

Ora, calcolare l'inverso dei valori misurati di rilassamento T1 o T2 e tracciare il grafico. Riportare questi valori in funzione della concentrazione di lantanio, espressa in millimolari, e interpolare il grafico con una retta. La pendenza della retta interpolata corrisponde all'attività di rilassamento, ovvero R1 o R2 rispettivamente per T1 e T2.

Qui osserviamo lo schema generale per la mediazione e la purificazione. Questo schema illustra il procedimento generale per la metazione e le ragioni alla base della scelta di diverse vie di purificazione. Qui vediamo un grafico rappresentativo dell'andamento del decadimento della luminescenza, nel quale il logaritmo naturale del decadimento è riportato in funzione del tempo; le pendenze delle rette ottenute da curve analoghe, necessarie per soluzioni acquose e di ossido di deuterio, vengono utilizzate nell'equazione uno per determinare il numero di coordinazione dell'acqua nei complessi contenenti oppio.

Un esempio rappresentativo di misurazioni di lività può essere osservato qui, con la pendenza della retta interpolata che corrisponde alla lività T di uno del campione. Oltre al numero di coordinazione dell'acqua e alla caratterizzazione della lività descritta nel protocollo, è inoltre importante caratterizzare i prodotti finali mediante tecniche chimiche standard. L'identità del composto può essere determinata mediante spettrometria di massa; spettri di massa rappresentativi, che mostrano i pattern isotopici diagnostici per complessi contenenti gadolinio e oppio, sono riportati qui.

Seguendo questa procedura, altri metodi come la spettroscopia ENDOR, l'HPLC e l'analisi elementare possono essere eseguiti per caratterizzare ulteriormente i complessi ottenuti. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare, purificare e caratterizzare complessi contenenti lantanidi che possono essere utilizzati per marcare macromolecole biologiche.