Bromodeossiuridina (BrdU) Etichettatura e successive ordinamento fluorescenza cellulare attivo per la cultura indipendente Identificazione di carbonio organico disciolto-degradanti batterioplancton

I microrganismi intervengono nella degradazione di numerose sostanze organiche disciolte o composti DOC, come nei sistemi fluviali e negli ambienti acquatici. Per comprendere appieno il ruolo dei microrganismi nella trasformazione del DOC, è necessario identificare simultaneamente la loro tassonomia e funzione. Questo video illustra una procedura per l'identificazione tassonomica di batteri liberi o plancton batterico che trasformano specifiche frazioni di DOC negli ambienti acquatici.

Dei campioni d'acqua raccolti da un ambiente di prova vengono processati e incubati con un composto di interesse e bromodesossiuridina, BRDU, che si incorpora nel DNA appena sintetizzato e nelle cellule attivamente in crescita. Successivamente, il plancton batterico marcato con BRDU viene etichettato con anticorpi anti-BRDU coniugati con ZI. Il plancton batterico con elevati livelli di marcatura BRDU viene isolato mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.

Il DNA viene quindi estratto dalle cellule ordinate e l'identificazione tassonomica viene effettuata in base ai risultati dell'analisi del gene dell'RNA ribosomiale 16S mediante PCR. Ciao, mi chiamo Steven Robbins del laboratorio della dottoressa Chen Mao del Dipartimento di Scienze Biologiche della Kent State University. Oggi s lu e io vi mostreremo un metodo indipendente dalla coltura per l'identificazione del plancton batterico degradatore di DOC negli ambienti acquatici.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'aggiunta di nutrienti seguita dall'analisi del DNA della comunità batterica, consiste nel concentrare l'analisi sui batteri altamente attivi, escludendo le cellule inattive e quelle con crescita lenta. In questo studio mostriamo l'identificazione di batteri associati alla pianta di plantain che utilizzano un particolare composto DOC. Tuttavia, questo metodo può essere applicato anche per studiare il plancton batterico che utilizza altri singoli composti DOC o gruppi di composti DOC, come gli esudati algali.

Preleviamo quindi alcuni campioni d'acqua e iniziamo. Prima di analizzare i campioni d'acqua per individuare il plancton batterico degradatore di DOC, i campioni devono essere opportunamente trattati. I campioni mostrati qui sono stati raccolti dalla costa della Georgia per rimuovere le particelle grandi e i VRE ER dal campione d'acqua.

Utilizzare una pompa peristaltica per trasferire l'acqua dal carboy di raccolta a un'unità di filtrazione dotata di un filtro con pori di dimensione pari a un micrometro. Successivamente, trasferire aliquote da 36 millilitri del filtrato in tre provette sterili in polipropilene da 50 millilitri, ciascuna contenente quattro millilitri di soluzione al 10% di paraformaldeide appena preparata. Incubare per due ore a temperatura ambiente per preservare le cellule, successivamente all'incubazione.

Versare l'acqua nella torre di filtrazione di un'unità di filtrazione a vuoto in vetro dotata di filtri a membrana bianchi con pori di dimensione pari a 0,22 micrometri ed applicare il vuoto per far passare la soluzione. Lavare il filtro applicando 10 millilitri di PBS attraverso il filtro a vuoto. Etichettare i filtri come controlli negativi e conservarli a meno 20 gradi Celsius.

Per creare un ecosistema sperimentale o un microcosmo, iniziare riempiendo sei fiale di vetro da un litro, preventivamente risciacquate, con 800 millilitri del campione d'acqua prefiltrato. Aggiungere BRDU a ciascun microcosmo fino a una concentrazione finale di 10 micromolare. Ruotare rapidamente la fiala a mano per mescolare.

Ogni campione verrà sottoposto a saggio in triplicato. Pertanto, aggiungere il composto modello di DOC a tre dei microcosmi. Qui, la reina viene aggiunta ai microcosmi a una concentrazione finale di 100 nanomolar.

Quindi aggiungere ai rimanenti tre microcosmi PBS sterile. Questi serviranno come controlli senza DOC; posizionare tutti i microcosmi in un incubatore sotto agitazione a 100 giri al minuto, al buio e alla temperatura in situ, pari a 25 gradi Celsius. In questi momenti, prelevare campioni ai tempi 0, 8, 16 e 24 ore.

Prelevare 36 millilitri da ciascun microcosmo in un tubo sterile di polipropilene da 50 millilitri contenente quattro millilitri di paraformaldeide fresca al 10%, incubare per due ore a temperatura ambiente per fissare le cellule. Successivamente, filtrare le cellule fissate attraverso filtri in membrana bianca con porosità di 0,22 micrometri. Applicare 10 millilitri di PBS attraverso il filtro sotto vuoto per rimuovere i residui di PFA.

Procedere immediatamente alla rilevazione immunocitochimica INS situ oppure conservare i filtri a meno 20 gradi Celsius per il saggio di incorporazione di BRDU nel plancton batterico. Iniziare lasciando i filtri del campione a temperatura ambiente per alterare la parete cellulare batterica. Posizionare il filtro su un'unità di filtrazione, quindi pipettare un millilitro di soluzione di lisozima sul filtro in modo da coprire le cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, applicare un vuoto per rimuovere la soluzione. Una volta che la soluzione è passata attraverso il filtro, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di PBS ed applicare un vuoto. Poi, per compromettere ulteriormente la parete cellulare, aggiungere un millilitro di soluzione di proteinasi K sul filtro in modo da coprire le cellule.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare con PBS per ottenere strati singoli di DNA. Aggiungere un millilitro di soluzione di esonucleasi per coprire le cellule sul filtro.

Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare il filtro facendo passare 10 millilitri di PBS attraverso il filtro sotto vuoto. Successivamente, tagliare i bordi del filtro per rimuovere la porzione priva di cellule.

Quindi, su una superficie asciutta pulita con alcol, utilizzare una lama sterile per tagliare il filtro in otto pezzi di dimensioni uguali. Sono necessarie otto camere di incubazione con guarnizione a telaio; posizionare un ottavo del filtro in ciascuna camera di incubazione con guarnizione a telaio, con il lato del campione rivolto verso l'alto. Una volta assemblate le camere, utilizzare il kit di flusso per la proliferazione cellulare Roche Intu per rilevare in situ le cellule marcate con A-B-R-D-U.

Una volta completate le procedure di incubazione, rimuovere la sezione del filtro dalla camera di incubazione e posizionarla su una superficie sterile; utilizzando una lama sterile, tagliare la sezione del filtro in piccoli pezzi. Trasferire i frammenti di filtro in una provetta microcentrifuga da due millilitri contenente un millilitro di PBS, chiudere ermeticamente la provetta e sigillarla con parafilm. Successivamente, incubare la provetta in un incubatore agitato a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 10 minuti.

Dopo l'incubazione, fissare la provetta e vorticare alla velocità massima. Per cinque minuti, pipettare il sopranatante in una provetta sterile in polipropilene da 15 millilitri. Successivamente, risospendere il filtro in PBS e ripetere i passaggi di vorticosità e incubazione altre due volte, aggiungendo ogni volta il sopranatante alla stessa provetta da 15 millilitri per ogni campione.

Conservare le cellule risospese a quattro gradi Celsius. Il campione deve essere analizzato mediante fax entro due giorni. Infine, separare le cellule per ottenere la popolazione con elevato livello di incorporazione di BRDU.

Qui viene utilizzato un citometro a flusso BD fax area e il relativo software. Una volta che le cellule sono state ordinate, la popolazione arricchita in BRDU può essere analizzata per determinarne l'identità tassonomica. Per amplificare i geni dell'RNA ribosomiale 16S dei batteri filtrati, eseguire delle PCR: pipettare le cellule ordinate su un filtro in policarbonato bianco con porosità di 0,22 µm e, utilizzando una lama sterile, tagliare i bordi del filtro privi di cellule attivando la pompa a vuoto.

Tagliare il filtro in quattro pezzi di dimensioni uguali per ogni condizione, posizionare un singolo pezzo di filtro in ciascuna delle tre provette per reazione PCR con le cellule rivolte verso l'interno della provetta. Aggiungere 45 microlitri di acqua per PCR. Lasciare che la sezione del filtro si immerga completamente nell'acqua.

Successivamente, aggiungere due perle Roche illustra pure T ready to go PCR e vortexare brevemente per favorire la dissoluzione delle perle. Quindi aggiungere due microlitri ciascuno di primer forward e reverse del gene dell'RNA ribosomiale 16 s.

Aggiungere un microlitro di BSA per aiutare ad assorbire gli inibitori dell'amplificazione oppure un microlitro di acqua. Eseguire l'amplificazione PCR su un termociclatore. Si raccomanda un programma di PCR con temperatura decrescente (touchdown), in cui la temperatura di annealing diminuisce progressivamente da 62 a 52 gradi Celsius di un grado Celsius per ciclo, seguito da 15 cicli a 52 gradi Celsius.

Confermare l'amplificazione PCR mediante elettroforesi su gel all'1% di agarosio colorati con bromuro di etidio, escindere gli ampliconi PCR dal gel e purificarli utilizzando un kit di estrazione rapida da gel KaiGen cayo. Dopo la purificazione su gel PCR, raccogliere insieme gli ampliconi dello stesso campione. Gli ampliconi di DNA ribosomiale 16 s purificati sono ora pronti per diverse analisi molecolari.

I campioni sono stati raccolti da un sito costiero della Georgia ed elaborati per studiare batteri degradanti la racina seguendo le procedure descritte in questo video. La racina è un composto poliammidico che può essere trovato ubiquitariamente negli ambienti marini. Può fungere da fonte di nutrimento ed energia per i batteri marini, come mostrato qui.

L'analisi fattoriale dei campioni ha rivelato che, dopo un'incubazione di 24 ore, in microcosmi arricchiti con Racine si è sviluppato un gruppo di batteri con un livello più elevato di intensità di fluorescenza di FXI, positivamente correlato al grado di incorporazione di BRDU. Queste cellule sono state definite cellule con elevata incorporazione di BRDU o HI e si prevedeva che contenessero principalmente batteri degradatori di Racine. Nessun hi.

Sono state trovate cellule nei controlli senza aggiunta, che contenevano solo cellule con livelli più bassi di incorporazione di BRDU, indicate come cellule lii, che si prevedeva contenessero principalmente plankton batterico non in grado di utilizzare. Le cellule Racine HI aggiunte sono state ordinate in provette separate e poi raccolte su filtri membrana. Degli ampliconi parziali del gene dell'RNA ribosomiale 16S sono stati ottenuti dopo la PCR su filtro e confermati mediante elettroforesi su gel.

Dopo il filtraggio, può essere eseguita anche l'amplificazione mediante PCR di geni funzionali per esaminare la diversità funzionale tra le cellule ordinate. Ti abbiamo appena mostrato come separare fisicamente e identificare cellule batteriche funzionali in ambiente acquatico utilizzando un approccio che combina la citometria a flusso con attivazione fluorescente e l'incorporazione di BRDU. Ricorda, è obbligatorio indossare camice da laboratorio e guanti durante l'esecuzione di questa procedura.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.