Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro

Test della proteina. L'interazione tra proteine è indispensabile per l'analisi della funzionalità proteica. Questo video presenta un saggio in vitro di legame tra proteine per verificare l'interazione tra una proteina di membrana immobilizzata e una proteina solubile.

Prima di tutto, le proteine di fusione vengono clonate, espresse ed estratte. La proteina insolubile marcate viene immobilizzata su una membrana di nitrocellulosa e trattata per essere ripiegata nella sua conformazione nativa. Successivamente, la membrana viene sottoposta a sonda con proteine solubili marcate e viene eseguita una immunodot-blot per rilevare le proteine.

Se le proteine marcate interagiscono, vengono catturate dalla proteina immobilizzata sulla membrana e il segnale derivante dal blot immunochemiluminescente sarà osservato. Pertanto, questo saggio fornisce un metodo affidabile per verificare l'interazione tra una proteina insolubile e una proteina in soluzione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di pull-down con GST, è che consente di valutare in modo affidabile il legame tra una proteina insolubile e una proteina solubile in vitro.

Il primo passaggio di questa procedura consiste nel generare proteine marcate geneticamente per il rilevamento. Iniziare clonando la proteina che verrà immobilizzata sulla membrana. Tale proteina, indicata di seguito come pro Im (proteina immobilizzata), va inserita in un vettore di espressione che codifica per un marcatore di grandi dimensioni, come GST; il vettore di espressione vuoto, che codifica soltanto per il marcatore, verrà utilizzato come controllo negativo per la proteina immobilizzata ed è indicato come pro IM nc.

Successivamente, clonare la proteina che verrà utilizzata come sonda solubile in un vettore di espressione, codificante un marcatore diverso come strep due. Questa verrà indicata come prosol per proteina solubile in quanto controllo negativo; clonare una proteina solubile di controllo negativo nello stesso vettore di espressione. Questa verrà indicata come Prosol NC per proteina solubile di controllo negativo.

Successivamente, utilizzare un sistema di espressione proteica come *E. coli* o virus baculovirale per esprimere le proteine marcate; il sistema di espressione impiegato deve essere scelto attentamente in base alla necessità di modifiche post-traduzionali. Estrarre le proteine espresse dall'organismo di interesse. Per pro IM e pro I mnc Resus.

Sospendere le cellule in buffer di caricamento per elettroforesi SDS-PAGE contenente un cocktail di inibitori della proteasi. Successivamente, far bollire le cellule per cinque minuti, quindi centrifugarle per rimuovere il precipitato ed estrarre Prosol e prosol NC. Utilizzare procedure standard. Il pro IMS può essere estratto in condizioni denaturanti poiché le proteine verranno ripiegate dopo essere state immobilizzate sulla membrana di nitrocellulosa.

Tuttavia, il prosol dovrebbe essere estratto per ottenere una conformazione nativa, poiché verrà aggiunto al buffer di legame una volta che le proteine marcate sono state estratte. Determinare la concentrazione delle proteine ricombinanti utilizzando un metodo standard, come il kit per saggio proteico BioRad. Se per il saggio verrà utilizzato un estratto grezzo anziché una proteina purificata.

Stimare la concentrazione della proteina di interesse mediante densitometria di scansione della banda corrispondente su un gel di poliacrilammide SDS colorato con kumasi, utilizzando concentrazioni note di BSA come riferimento. Quindi tracciare la curva standard in base alle intensità del segnale misurate mediante densitometria di scansione della BSA e calcolare la quantità di proteina contenuta nell'estratto grezzo.

Il passo successivo della procedura consiste nell'immobilizzare pro Iam e pro IAM NC sulla membrana. Caricare un microgrammo, ciascuno, di estratti di pro Iam e pro IAM NC in duplicato su un gel di poliacrilammide SDS. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dalle lastre di vetro e posizionarlo in 100 millilitri di buffer di trasferimento, quindi incubare con agitazione delicata per 20 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, eseguire un'analisi mediante western blot per trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa; dopo il trasferimento, consentire alle proteine legate alla membrana di ripiegarsi. Posizionare la membrana in 15 millilitri di tampone A e incubare con agitazione delicata. Per rimuovere l'SDS residuo, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione la membrana dal buffer. Quindi posizionare la membrana in 25 millilitri di buffer di denaturazione. Incubare per due ore a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Durante l'incubazione, la membrana di nitrocellulosa diventerà opaca. Successivamente, utilizzando pinzette, trasferire la membrana in 25 millilitri di TBS e incubare con agitazione delicata per cinque minuti. Durante questo passaggio, la membrana riprende il suo colore bianco originale.

Successivamente, trasferire la membrana in 25 millilitri di tampone di legame. Incubare a quattro gradi Celsius con agitazione delicata per tutta la notte. Successivamente, la proteina solubile verrà utilizzata per sonda la membrana alla ricerca della proteina immobilizzata.

Per prima cosa, preparare i tamponi di ibridazione diluendo da uno a 10 microgrammi di prosol e prosol NC in provette separate contenenti 10 millilitri di tampone di legame fresco. Successivamente, trasferire il tampone in un sacchetto per ibridazione. Poi, tagliare la membrana in due strisce, entrambe contenenti pro IM e pro IAM nc.

Queste membrane verranno collocate nel buffer di ibridazione. Trasferire ogni membrana nella soluzione di ibridazione prosol o prosol NC e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere le membrane dalle soluzioni di ibridazione e risciacquare tre volte per 15 minuti in TBS.

Per visualizzare le interazioni proteina-proteina, bloccare la membrana con latte scremato al 2,5% in TBST per un'ora. Dopo l'incubazione, posizionare le membrane bloccate nella soluzione di anticorpo primario. In questo caso viene utilizzato l'anticorpo policlonale da coniglio anti-strep due.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata dopo l'incubazione. Risciacquare le membrane in 20 millilitri di TBST per 15 minuti e due volte per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Successivamente, posizionare le membrane nella soluzione di anticorpo secondario coniugato con HRP. In questo caso, viene utilizzato un anticorpo anti IgG da coniglio coniugato con HRP.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Lavare le membrane con 20 millilitri di TBST per 15 minuti e due volte per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata come in precedenza; dopo l'ultimo risciacquo in TBS, visualizzare l'interazione proteina-proteina utilizzando un substrato chemiluminescente HRP da Here Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.

Il substrato per la HRP viene utilizzato dopo il blotting immuno del prosol. Lavare la membrana con TBST per 15 minuti e quindi due volte per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, riutilizzare le membrane con l'anticorpo primario per il marcatore da pro.

Incubare con l'anticorpo secondario appropriato. Visualizzare PRO I e pro Im NNC rilevando la chemiluminescenza per convalidare l'identità delle bande ottenute nel saggio di sovrapposizione su membrana proteica. L'interazione tra le proteine A e K e YFP e MP CYFP è stata valutata in cellule epidermiche di tabacco utilizzando il metodo descritto in questo video, come mostrato qui.

Quando è stata valutata la complementazione della fluorescenza biomolecolare, è stato ricostruito un forte segnale YFP. Questo segnale BFC si è accumulato nei punti periferici della cellula, caratteristici del plasma de poiché MP è una proteina altamente insolubile. Quando espressa in batteri o in piante, è stato adottato il saggio di sovrapposizione della membrana proteica per convalidare questa interazione.

Estratti proteici in vitro contenenti un microgrammo di GST MP o di GST non fuso sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS, seguita da trasferimento elettroforetico su membrana di nitrocellulosa. Quando questi profili proteici sono stati sottoposti a sonda con a nnk solubile strep due GST mp, solo il GST MP, e non il GST non fuso, ha mostrato capacità di legame. Inoltre, quando lo stesso insieme di profili proteici è stato sottoposto a sonda con una proteina non correlata, la chinasi del NADH citoplasmica di Arabidopsis etichettata con strep due, non è stato osservato alcun legame, dimostrando ulteriormente la specificità dell'interazione tra A NK MP. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rigenerare correttamente le proteine immobilizzate seguendo il protocollo presentato.