Valutazione della immunologicamente rilevanti dinamiche Caratteristiche strutturali del terziario di HIV-1 sequenza R2 Loop Corona V3 da Ab initio Pieghevole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare le preferenze strutturali dinamiche della sequenza peptidica della corona V3 della ceppa R2 dell'HIV mediante il ripiegamento AR, e correlare i risultati con le note sensibilità alla neutralizzazione della ceppa R2. Questo viene ottenuto selezionando un frammento appropriato della corona del loop V3 della R2 da ripiegare con AR bonni. Come secondo passaggio, si esegue la simulazione del ripiegamento, che esplora tutte le possibili conformazioni del frammento della corona R2 e registra le conformazioni più probabili in un file stack.

Successivamente, le conformazioni registrate vengono analizzate per determinare la preferenza strutturale dinamica della corona R due V tre che potrebbe spiegare la sua sensibilità alla neutralizzazione. Si ottengono risultati che mostrano una preferenza per un'elica beta rigida nelle posizioni da 12 a 14 del loop V tre, in base alla struttura secondaria, alla preferenza e alla distribuzione energetica dell'insieme delle conformazioni analizzate. Salve, sono Timothy Cardozo, che vi parla dal mio laboratorio del Dipartimento di Farmacologia della New York University School of Medicine.

Oggi vi mostreremo un procedimento per il ripiegamento ab initio di un'ansa flessibile su una proteina virale immunogenica dell'HIV-1 nota come GP120. L'ansa flessibile è conosciuta come l'ansa V3 della glicoproteina dell'involucro superficiale del virus HIV-1 e la sua estremità è chiamata corona dell'ansa V3. Questa è la regione che ripiegheremo.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per aiutarci a identificare percorsi produttivi verso la progettazione efficace di vaccini contro l'HIV. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, selezionare la sequenza del dominio V3 del capside da piegare in silico.

Studi precedenti di questo laboratorio indicano che le posizioni da 10 a 22 di qualsiasi sequenza del loop V3 forniscono i migliori risultati; eseguire gli esperimenti di ripiegamento di armenio mediante i menu a discesa di facile utilizzo nell'interfaccia grafica utente o GUI del software di modellizzazione molecolare ICM Pro. Per prima cosa, la struttura atomica tridimensionale del peptide corrispondente a questa sequenza deve essere costruita nello spazio virtuale del computer. Per costruire la struttura atomica tridimensionale, andare nel menu file e selezionare nuovo.

Questo mostrerà una schermata con diverse schede. Selezionare la scheda del peptide e incollare o digitare la sequenza nel campo di testo. Fare clic su OK per generare la struttura tridimensionale del peptide.

La struttura verrà visualizzata nella finestra grafica di ICM. Una volta costruita la struttura tridimensionale, accedere al menu della meccanica molecolare e selezionare "minimize", che apparirà come un menu laterale. Dal menu laterale, scegliere "global".

Questo mostrerà una schermata con diversi campi di inserimento e caselle di controllo già selezionate con parametri predefiniti. Se necessario, modificare la selezione per scegliere il peptide da ripiegare. Regolare la durata e la precisione della simulazione modificando rispettivamente il numero di spostamenti globali e il numero di chiamate di minimizzazione locale.

Selezionare tutto per la piegatura di tutti gli atomi del peptide. Quindi selezionare "salva filmato" per creare un file video della piegatura. Infine, fare clic su applica per avviare la piegatura nella finestra grafica.

L'algoritmo inizia a ripiegare il peptide in diverse conformazioni, calcolando e registrando l'energia del peptide per ciascuna conformazione. Al termine, verranno identificate e visualizzate sul computer la conformazione più stabile energeticamente del peptide, nonché conformazioni alternative con energia quasi identica. Eseguire il ripiegamento del peptide. L'utilizzo dell'interfaccia grafica mostra l'aspetto del ripiegamento, ma non consente una selezione ideale dei parametri per il ripiegamento del dominio V tre loop crown.

A questo scopo, è preferibile eseguire il ripiegamento dalla riga di comando non grafica utilizzando uno script. Uno script è semplicemente una serie di comandi testuali salvati riga per riga in un documento o file di testo, che vengono forniti automaticamente al programma ICM ed eseguiti uno dopo l'altro per ripiegare il loop V tre mediante uno script di righe di comando. Innanzitutto, creare un file di testo da salvare sul disco rigido del computer in una directory locale. Come in precedenza, iniziare costruendo il peptide nello spazio virtuale del computer.

Quindi assegnare un nome alla simulazione e impostare il numero di variabili libere, ovvero i legami chimici nel peptide lasciati liberi di ruotare durante il ripiegamento. Successivamente, specificare per quanto tempo verrà eseguita la simulazione per ottenere un ripiegamento ottimale del loop V tre. Questo dipenderà dal numero di variabili libere identificate nel passaggio precedente per determinare la precisione della ricerca conformazionale nell'esperimento; impostare il numero di passaggi di ricerca da eseguire in ciascun minimo locale.

Quindi impostare altri parametri che sono stati ottimizzati per la simulazione sulla base di ricerche precedenti, inclusi la minimizzazione della temperatura, il gradiente e la distribuzione di probabilità. Dopo aver impostato i parametri sperimentali, indicare quali calcoli energetici verranno utilizzati durante il ripiegamento. In questo caso, l'energia di Vander Vi è indicata da VW peptidica interna.

L'energia è indicata da 14 legami a idrogeno; l'energia di legame è indicata da HB elettrostatica. L'energia è indicata da El Salvation. L'energia è indicata da SF e l'entropia è indicata da EN. Specificare le impostazioni finali, incluse le angolazioni preferite della catena principale e delle catene laterali da esplorare e la conformazione iniziale.

Infine, scrivere il comando per eseguire e salvare il calcolo. Una volta che lo script è stato scritto e salvato come file di testo, eseguirlo dal prompt dei comandi del sistema operativo del computer. Come in precedenza, verranno identificate e salvate nel file del progetto la conformazione del peptide più stabile energeticamente, nonché conformazioni alternative con energia comparabile, per la visualizzazione sul computer.

Una volta completato il calcolo, aprire il file selezionando "apri file" dal menu a tendina di EE. Visualizzare la molecola cliccando sulla casella di controllo accanto ad essa nel pannello dell'area di lavoro, quindi selezionare la vista sovrapposta della meccanica molecolare. Per visualizzare la serie ordinata per energia delle principali conformazioni del peptide risultanti dal ripiegamento, fare clic sullo strumento di tracciamento grafico nell'angolo in basso a destra del pannello della serie per tracciare i risultati.

Prima fare clic su OK nella finestra risultante, quindi fare clic sulla scheda centrale del grafico denominata best confo. Successivamente, fare clic sulla prima riga della tabella dei risultati, che corrisponde alla conformazione a energia più bassa trovata nella ricerca. La struttura del peptide si riorganizzerà nella sua conformazione a energia più bassa nella finestra grafica.

Analizzare questa conformazione per evidenziare caratteristiche tipiche di un'elica alfa o di un foglietto beta, in particolare nelle prime cinque posizioni del peptide. Selezionare questa regione nella sequenza e fare clic sull'icona a forma di bastoncino in alto a sinistra dello schermo per visualizzare tutti gli atomi. Successivamente, è necessario analizzare lo stack dei risultati energetici per tracciare le migliori conformazioni.

Se la conformazione a energia più bassa è separata da un divario significativo rispetto alle altre conformazioni, ciò indica una tendenza verso una struttura rigida. Per valutare i risultati, aprire la provetta del progetto e scegliere la vista sovrapposta della meccanica molecolare: verrà visualizzata una tabella delle conformazioni sovrapposte. Visualizzare le conformazioni sovrapposte cliccando sull'icona dell'istogramma.

Infine, fare clic su "play" della sequenza di meccanica molecolare per creare un filmato della sequenza e visualizzare le preferenze conformazionali rivelate dal ripiegamento qui descritto. Sono mostrati i risultati per il ripiegamento della R2. La conformazione non è elicoidale alfa e corrisponde a una coil casuale, come previsto per le regioni di loop V3, in particolare nel frammento compreso tra il residuo 12 e il 14.

Nel loop V tre, si osserva chiaramente una preferenza conformazionale per i foglietti beta lungo tutta la struttura, mentre si notano pochissime conformazioni ad elica alfa. Una conformazione locale a foglietto beta è riconoscibile dalla sua forma lineare allungata. Questa è la posizione della sequenza insolita di isoleucina-prolina-metionina dello strain R due, una sequenza rara tra gli strain di HIV in questa posizione, e che si ipotizza sia responsabile delle caratteristiche insolite dello strain R due.

Inoltre, si osserva un gap energetico di quasi tre unità tra la conformazione a energia più bassa e la seconda conformazione a energia più bassa. Pertanto, la struttura abbandona momentaneamente la conformazione a energia minima per meno dell'1% del tempo, suggerendo che la corona R due V tre e la sua conformazione locale con tensione beta nelle posizioni da 12 a 14 presentano una struttura più rigida piuttosto che essere completamente flessibili di natura. Vi abbiamo appena mostrato come ripiegare una sequenza a corona con loop V tre utilizzando l'algoritmo abio implementato nel software ICM, e vi abbiamo mostrato come analizzare i risultati utilizzando la tensione R due del virus HIV.

Ad esempio, durante questa procedura, è importante scegliere attentamente l'identità del peptide ripiegato corrispondente a un frammento della corona V, ed è altresì fondamentale interpretare i risultati in relazione alla preferenza conformazionale e all'energia, avvalendosi della consulenza di un esperto in modellistica molecolare. Questo è tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.