Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura

[Narrator] Questo protocollo incorpora la tecnica asettica nei metodi di semina utilizzati per isolare, propagare o enumerare microrganismi come batteri e fagi. Le procedure includono la semina per spiccatura di colture batteriche per isolare singole colonie, la semina in profondità per determinare la concentrazione di batteri e la semina superficiale per enumerare le colonie batteriche vitali. Sovrapposizioni di agar morbido vengono utilizzate per isolare fagi ed enumerare le placche, mentre la semina per replica trasferisce le cellule da una piastra a un’altra mantenendo un identico schema spaziale. In definitiva, le applicazioni pratiche di queste tecniche nella coltivazione di microrganismi spaziano dall'identificazione di batteri in ambienti naturali fino ai progressi tecnologici nel campo della genetica molecolare e nei saggi biologici ad alto rendimento.

- In generale, le persone nuove rispetto a questi metodi di semina possono incontrare difficoltà poiché le manipolazioni richiedono movimenti accurati e coordinati, evitando il contatto con superfici non sterili. L'apprendimento di queste procedure di routine richiede formazione ed esercitazione. Le procedure saranno dimostrate dalla coordinatrice del mio laboratorio, la dottoressa Kris Reddi.

- [Narratore] Iniziare il lavoro con microrganismi conoscendo le norme di laboratorio e le precauzioni di sicurezza, inclusa la classificazione del rischio biologico, la decontaminazione e lo smaltimento dei rifiuti. Verificare che tutti gli strumenti, le soluzioni e i terreni per le procedure di semina siano sterili. Inoltre, predisporre un'area di lavoro pulita. Pulirla con un disinfettante. Allestire un becco Bunsen collegato a una linea del gas, sistemando le forniture necessarie con i materiali opportunamente etichettati. Procedere quindi a lavare accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida. Prima, bagnare le mani con acqua corrente tiepida, quindi applicare e distribuire bene il sapone. Strofinare energicamente le mani generando attrito su tutte le superfici, compresi i pollici, il dorso delle dita, il dorso delle mani e sotto le unghie. Risciacquare quindi accuratamente per rimuovere il sapone residuo e asciugare con tovaglioli di carta prelevati da un erogatore. Infine, utilizzando un tovagliolo di carta pulito, chiudere il rubinetto. La tecnica del piatto a striscia è progettata per isolare colture pure di batteri, o colonie, da popolazioni miste mediante semplice separazione meccanica. Prelevare un piatto in agar da una cella frigorifera a quattro gradi Celsius e preriscaldarlo a temperatura ambiente. Selezionare uno strumento dall'insieme di strumenti disponibili per eseguire la strisciatura del piatto. Assicurarsi che il piatto sia asciutto e privo di condensa sul coperchio. Etichettare il fondo di un piatto in agar lungo il bordo. Una volta raggiunta una certa abilità, utilizzare un singolo piatto per più campioni. Accendere quindi un becco Bunsen per sterilizzare l'ansa metallica. Iniziare a tre-quattro pollici dall'ansa metallica, posizionando il filo nella punta del cono blu, la parte più calda della fiamma del becco Bunsen. Quando il metallo diventa incandescente, spostare il filo in modo che la fiamma si avvicini all'ansa. Per raffreddare l'ansa, toccare il bordo del terreno in agar producendo un suono sfrigolante. Continuare quindi a prelevare l'inoculo sull'ansa. Sollevare la metà inferiore del piatto. Muovere l'ansa avanti e indietro dal bordo al centro nel primo quadrante del piatto. Riposizionare il piatto capovolto sul coperchio. Sterilizzare nuovamente l'ansa metallica. Ruotare la piastra di Petri di 90 gradi. Toccare l'ansa vicino alla fine dell'ultima strisciatura, utilizzando un movimento avanti e indietro, sovrapponendo la metà finale delle strisce nel primo quadrante, quindi spostarsi nel secondo quadrante vuoto. Una volta completato il secondo quadrante, posare il piatto. Ripetere la procedura di strisciatura per il terzo e il quarto quadrante, evitando il contatto con il primo quadrante. Per eseguire la strisciatura con un bastoncino sterile piatto, tenere l'estremità stretta delicatamente tra pollice e anulare con un angolo di 10-20 gradi rispetto al terreno, utilizzando l'estremità larga per eseguire le strisce nei quadranti. Capovolgere il piatto sul coperchio tra un quadrante e l'altro e smaltire correttamente il bastoncino. Procedere quindi all'incubazione dei piatti strisciati capovolti. La tecnica del piatto di versamento permette di enumerare il numero totale di unità formanti colonie sulla superficie e all'interno dell'agar di un singolo piatto. Impostare un timer per 10 minuti, quindi trasferire 18 millilitri di terreno in agar fuso da un bagno termico a 55 gradi Celsius a un blocco riscaldante a 48 gradi Celsius e lasciare equilibrare per 10 minuti. Etichettare il fondo di una piastra di Petri sterile. Se applicabile, includere il fattore di diluizione. Ora dispensare 1 millilitro di campione al centro della piastra di Petri. Chiudere il coperchio. Rimuovere il tappo dal tubo di agar fuso e passare il bordo del tubo aperto attraverso la fiamma. Versare con attenzione l'agar nella piastra di Petri. Chiudere il coperchio e quindi mescolare il campione con l'agar ruotando delicatamente la piastra. Attendere 30 minuti per permettere all'agar di solidificarsi. Una volta solidificato l'agar, capovolgere e posizionare la piastra in un ambiente caldo. La tecnica della semina a strato sottile mira a separare i microrganismi contenuti in un piccolo volume di campione, distribuendo le colonie risultanti uniformemente sulla superficie dell'agar. Portare un piatto a temperatura ambiente ed etichettarlo opportunamente. Posizionare il piatto sul giradischi. Pipettare 0,1 millilitri di campione al centro dell'agar e chiudere il coperchio. Espellere il becco in un contenitore per rifiuti. Immergere l'asta metallica in un becher contenente etanolo al 70%, coprendo tutta la parte inferiore dello spargitore e il primo pollice dello stelo, quindi farlo sgocciolare. Accendere l'eccesso di etanolo passandolo attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Successivamente, aprire il coperchio del piatto in agar e raffreddare lo spargitore toccandolo sull'agar lungo il bordo vicino al bordo. Ruotare lentamente il giradischi. Tenendo delicatamente lo spargitore sulla superficie dell'agar, distribuire gradualmente il campione uniformemente su tutto il piatto con un movimento avanti e indietro mentre il giradischi ruota. Chiudere il coperchio e lasciare assorbire il campione per almeno cinque minuti. Quindi, incubare il piatto capovolto. Prima, etichettare correttamente il piatto in agar. Aprire il coperchio del piatto in agar. Poi aprire il contenitore di perline di vetro pre-sterilizzate e passare il bordo attraverso la fiamma. Dispensare con attenzione 10-12 perline di vetro sterili su un piatto in agar. Chiudere il coperchio del piatto e passare il bordo del contenitore delle perline di vetro attraverso la fiamma prima di riposizionare il tappo. Ora, pipettare il campione al centro dell'agar. Con un movimento orizzontale, agitare delicatamente le perline sulla superficie dell'agar sette volte. Se eseguito correttamente, la procedura produce un suono simile a quello di maracas. Ruotare il piatto di 60 gradi e agitare orizzontalmente nuovamente sette volte. Ancora, ruotare il piatto di 60 gradi e ripetere l'agitazione. Verificare che il campione sia stato assorbito. Quindi, versare le perline contaminate in un becher di raccolta contrassegnato contenente ipoclorito di sodio al 10%. Incubare il piatto capovolto. Il saggio delle placche è comunemente usato per rilevare e quantificare i batteriofagi. Coltivare i batteri indicatore in fase esponenziale e conservarli sul ghiaccio. Quindi, etichettare due microprovette sterili rispettivamente come fago e controllo, aggiungendo 50 microlitri di campione di fago o tampone a ciascuna. Successivamente, agitare delicatamente la coltura batterica nel flacone, trasferire un'aliquote di batteri in una provetta sterile e vorticare delicatamente i batteri indicatore, quindi aggiungere 500 microlitri di batteri a ciascun tubo di assorbimento. Mescolare agitando delicatamente le provette. Mai vorticare o pipettare vigorosamente i campioni di fago. Incubare la miscela di fago e batteri a una temperatura appropriata per il ceppo indicatore per 20 minuti. Nel frattempo, trasferire due provette di agar morbido da un bagno termico a 55 gradi Celsius a un blocco riscaldante a 48 gradi Celsius. Lasciare equilibrare per 10 minuti. Etichettare due piastre di agar duro nutriente prive di condensa, pre-equilibrate a temperatura ambiente. Rimuovere una provetta di agar morbido dal blocco riscaldante e verificare che il contenuto non sia troppo caldo al tatto. Successivamente, trasferire in modo asettico la miscela dal tubo di assorbimento del fago alla provetta di agar morbido. Quindi, ruotare rapidamente tra i palmi per mescolare il contenuto. Tenendo la provetta in una mano, aprire il coperchio della piastra di agar duro con l'altra mano. Versare immediatamente l'intero contenuto della provetta sulla superficie di una piastra di agar duro. Oscillare rapidamente e delicatamente la piastra. Chiudere il coperchio e posizionare la piastra in piano per 30 minuti fino a quando l'agar morbido si solidifica. Successivamente, ripetere la procedura per il tubo di assorbimento del controllo, trasferendo la miscela di controllo in una provetta di agar morbido. Mescolarla, versarla su una piastra di agar duro, oscillarla e lasciare solidificare l'agar morbido per 30 minuti. Ispezionare le piastre per la formazione di placche. Per isolare una placca da una miscela eterogenea, perforare con attenzione il centro con un bastoncino sterile e trasferire l'inoculo in una microprovetta sterile contenente 100 microlitri di tampone per fago. Continuare a purificare questo lisato ripetendo il saggio delle placche da tre a sei volte con diluizioni seriali, se necessario. Il trapianto per replica sfrutta un fenotipo selezionabile consentendo il confronto della crescita cellulare su una piastra primaria con piastre secondarie. Tracciare una griglia sul fondo della piastra, etichettare la piastra primaria e numerare i quadrati risultanti. Ora, utilizzare una tecnica asettica per prelevare un bastoncino pre-sterilizzato dal becher, tamponare il centro di ogni quadrato con un campione cellulare e smaltire il bastoncino in un apposito contenitore per rifiuti. Incubare la piastra primaria. Impilare la piastra primaria e tutte le piastre secondarie. Posizionare un segno di orientamento sul lato della metà inferiore delle piastre. Rimuovere quindi un panno di velluto sterile dall'involucro e posizionarlo sul blocco cilindrico. Successivamente, posizionare il supporto allineando i segni sul supporto con quelli sul blocco. Notare il segno di orientamento sul blocco e sul supporto. Rimuovere quindi il coperchio dalla piastra primaria. Allineare i segni di orientamento sulla piastra e sul blocco. Abbassare la piastra in modo che la superficie dell'agar entri in contatto con il panno di velluto. Utilizzando le dita, premere leggermente ma uniformemente sul retro della piastra primaria, quindi sollevarla con attenzione dal blocco. Verificare che l'impronta delle cellule sia visibile sul velluto. Riposizionare il coperchio sulla piastra. Ripetere quindi in sequenza il protocollo sul panno di velluto con ciascuna delle piastre secondarie. Utilizzare l'impronta delle cellule dalla piastra primaria per inoculare fino a otto piastre secondarie, ordinate dalla più sfavorevole alla più favorevole come substrato. Infine, come controllo positivo, per l'ultima piastra della serie, utilizzare un terreno in agar in cui tutti i ceppi testati dovrebbero crescere. Fissare insieme con del nastro le piastre capovolte e incubarle. Ispezionare le piastre secondarie per la crescita. Spegnere il becco Bunsen e quindi riporre tutti gli strumenti. Posizionare l'abbigliamento da laboratorio contaminato, la vetreria e i rifiuti pericolosi nel contenitore di smaltimento appropriato. Pulire l'area di lavoro con disinfettante. Infine, lavare accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida. Serratia marcescens è un proteobatterio gram-negativo a forma di bastoncello che produce un pigmento rossastro chiamato prodigiosina. È comunemente trovato in crescita nei bagni e sulle tende della doccia. In questo esempio, la tecnica del piatto a striscia genera singole colonie nel quarto quadrante. Questa analisi dei batteri presenti in un campione d'acqua prelevato da una fontanella pubblica utilizza la tecnica del piatto di versamento. Notare la differenza nell'aspetto delle colonie. Le colonie superficiali sono grandi e di forma circolare, mentre alcune colonie superficiali sono molto piccole e di forma irregolare. La tecnica del piatto a strato sottile è un componente importante negli esperimenti di arricchimento, selezione e screening. Ad esempio, il metodo copacabana è uno strumento differenziante nel classico test bianco-blu in tecnologia del DNA ricombinante. Il fago T4 è un fago a DNA a doppio filamento virulento che infetta il suo ospite Escherichia coli causandone la lisi e il rilascio di fagi progenie. Questo saggio delle placche su agar EHA mostra fagi in zone di chiaro di circa un millimetro di diametro. In assenza di particelle di fago infettante, la crescita batterica produce una sospensione torbida di cellule nell'agar morbido in cui colonie distinte non sono visibili. Nella tecnica del sovraspalmamento con agar morbido, le morfologie delle placche possono variare. Ad esempio, qui lo stesso ceppo ospite di micobatterio produce morfologie di placche distinte in presenza di fagi distruttori di micobatteri rispetto ai fagi micobatterici MSSS. La potenza del trapianto per replica risiede nella capacità di esaminare simultaneamente un gran numero di microrganismi. In questo caso, quattro ceppi di Pseudomonas sono stati testati in duplicato per la crescita su tre diverse fonti di carbonio: acetammide, lattosio e glicina. Qui, la piastra primaria è un mezzo YTA completo inoculato con i quattro ceppi come indicato. I ceppi mostrano schemi di crescita variabili su piastre replica di mezzo minimo MSA arricchito con una singola fonte di carbonio: acetammide, lattosio o glicina. Tutti i ceppi crescono sull'ultima piastra di controllo positivo, confermando che le cellule sono state trasferite su tutte le piastre secondarie di questa serie. La tabulazione di questi risultati ottenuti con il trapianto per replica illustra lo screening simultaneo di diversi ceppi selvatici per specifici requisiti di crescita.

- Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire le procedure di semina senza contaminare i terreni o le colture, nonché di come utilizzare il metodo di semina più appropriato per ogni specifico compito sperimentale in laboratorio. L'acquisizione di padronanza di queste tecniche richiede esercitazione. Tuttavia, con un'adeguata formazione, le procedure di semina descritte in questo video diventeranno naturali durante il lavoro al banco del laboratorio.