Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Ciao, sono Victor Chi e sono uno studente laureato del laboratorio di Chandy presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California di Irvine. Oggi dimostrerò come colorare sezioni in paraffina utilizzando il kit A b, C di Vector Laboratories. Questa procedura prevede la dewaxing e l'idratazione di sezioni in paraffina, l'esecuzione di un recupero antigene indotto dal calore per esporre gli antigeni, il blocco della perossidasi e del legame proteico non specifico, l'incubazione con anticorpi primari CD4 e tirosina idrossilasi e con anticorpi secondari, e lo sviluppo e il montaggio del vetrino.

Iniziamo. Poiché i vetrini sono incastonati in paraffina, il primo passo consiste nel disperare i vetrini. Questa operazione viene solitamente eseguita in cappa chimica utilizzando tre beute di xilene, con tre lavaggi di cinque minuti ciascuno.

I vetrini vengono quindi posti in etanolo al cento per cento. Si noterà che la paraffina sui vetrini è scomparsa, ma fare attenzione a non toccare i vetrini con i guanti poiché il xilene scioglie la gomma dei guanti. Successivamente, si portano i vetrini in etanolo al cento per cento nel laboratorio, dove subiranno un gradiente di idratazione.

Qui parlerò del gradiente di idratazione a cui sottoporremo i nostri vetrini. Si inizia con due bagni di etanolo al cento per cento. Da qui, trasferiamo i vetrini in due bagni costituiti da etanolo al 95%.

Successivamente trasferiamo i nostri vetrini in un bagno di etanolo al 70% e, da qui, li trasferiamo in un bagno di etanolo al 50%. Dopo di che, trasferiamo i vetrini in etanolo al 30% e, due minuti dopo, li trasferiamo in acqua bidistillata. Una volta trattati con acqua bidistillata, lasciamo i vetrini in PBS.

Ora vi mostrerò come trasportare le lamelle da un bagno al successivo utilizzando le portalamelle. Il primo passo consiste nell'usare il supporto per portalamelle per rimuovere le lamelle e raschiarle delicatamente al fine di eliminare il liquido in eccesso, in modo da non trasferire troppo liquido nel bagno successivo. Successivamente, immergerle e attendere due minuti fino al prossimo cambio di gradiente.

Molte volte, quando i tessuti vengono fissati, l'antigene diventa mascherato in modo che l'anticorpo non possa legarvisi. Quindi ora vi mostrerò un metodo di recupero dell'antigene indotto dal calore, utilizzando citrato di sodio. Ora siamo qui al forno a microonde, dove procederò a smascherare il mio antigene CD eight, che tenterò di rilevare mediante immunohistochemia.

E qui inserirò la mia soluzione e la scaldarò al microonde per 15 minuti. Quindi faremo bollire il citrato di sodio con i nostri vetrini per 15 minuti per assicurarci che non si secchino. Osserveremo attentamente i vetrini e, qualora il liquido dovesse fuoriuscire, rabbocceremo con citrato di sodio per garantire che i vetrini rimangano idratati.

Quindi, prima di inserire i miei vetrini nel citrato di sodio, ho già preriscaldato la mia soluzione per 45 secondi. Successivamente ho inserito i vetrini nel citrato di sodio e ora sto riscaldando il citrato di sodio per 15 minuti, con i vetrini all'interno. Di solito la soluzione inizia a traboccare dopo circa due-due minuti e mezzo dal momento in cui inizia l'ebollizione.

A questo punto, fermerò e sostituirò il citrato di sodio perso con citrato di sodio fresco. Dopo aver fatto bollire il citrato di sodio per 15 minuti, dobbiamo rimuovere i nostri vetrini e la soluzione e farli raffreddare. Il modo migliore per farlo è chiudere il contenitore dei vetrini, versare il liquido in eccesso e passarlo sotto un getto di acqua fredda finché la soluzione all'interno del barattolo non si sarà raffreddata alla temperatura ambiente.

E questo di solito richiede circa da 10 a 15 minuti. Dopo aver rimosso i nostri vetrini dal lavandino, dobbiamo bloccare l'attività della perossidasi endogena nei tessuti. Per fare ciò, prepareremo una soluzione di perossido di idrogeno utilizzando perossido di idrogeno al 30% per ottenere una soluzione al 1% di perossido di idrogeno.

E da qui, trasferisco semplicemente i vetrini direttamente nella soluzione di perossido di idrogeno. Ora incuberemo i vetrini nel perossido di idrogeno per 20 minuti. Dopo trascorsi 20 minuti, al termine del blocco della perossidasi endogena, laverò via il perossido di idrogeno dai vetrini utilizzando lavaggi con PBS.

Quindi trasferirò i miei vetrini alla culla e li laverò con tre lavaggi, ciascuno dei quali durerà cinque minuti. Questi vetrini sono stati posizionati uno dietro l'altro per evitare il contatto con altri vetrini che potrebbero danneggiare il tessuto. Sto semplicemente facendo scivolare via i vetrini e li sto disponendo in modo che il tessuto non possa entrare in contatto con il vetro.

Trasferiamo quindi i nostri vetrini in PBS. Dopo aver lavato i vetrini con PBS, procederò ora a bloccare i vetrini per evitare il legame non specifico delle proteine mediante una soluzione contenente BSA al 5%, siero di capra al 5% e azoturo di sodio allo 0,1%. Si raccomanda di sostituire il siero di capra con quello di un'altra specie se si stanno utilizzando anticorpi di capra.

Quindi, ora metterò semplicemente i vetrini nel nostro portavetrini e lo riempirò con la nostra soluzione. Normalmente lo riempio solo a metà, in modo che il volume dei vetrini assicuri che i tessuti siano completamente immersi. Una cosa importante da verificare quando si inseriscono i vetrini nel contenitore è evitare che questi tessuti tocchino le pareti del contenitore.

Pertanto, per l'ultimo vetrino, ruotatelo verso l'interno in modo che il tessuto non tocchi il contenitore. Ora che ho bloccato i miei vetrini durante la notte, procederò a rimuovere la soluzione di blocco in eccesso con tre lavaggi di cinque minuti ciascuno in PBS. A questo punto, dobbiamo tracciare un cerchio attorno al tessuto utilizzando un bloccante liquido, in modo da ridurre al minimo la quantità di anticorpo utilizzata.

Se non si è preoccupati di conservare l'anticorpo, è sempre possibile incubare i vetrini nelle stesse camere utilizzate per il bloccaggio. Da questo momento in poi, vi mostrerò come disegniamo con il bloccante liquido attorno al nostro tessuto. Per prima cosa, rimuoviamo il sangue e il liquido in eccesso, avendo cura di non toccare il tessuto.

Pertanto, passare delicatamente agli angoli per rimuovere il liquido in eccesso. Ancora una volta, avendo molta, molta cura di non toccare il tessuto. Prendere il perno di bloccaggio del liquido, premere delicatamente per avviare il flusso e, da quel punto, delimitare il tessuto con la penna.

Lasciare asciugare il bloccante liquido per circa 15 secondi. A questo punto, è necessario aggiungere l'anticorpo primario. Utilizzando una pipetta, assicurarsi di ricoprire il tessuto con l'anticorpo primario e trasferirlo nella scatola a umidità controllata.

Quindi utilizziamo un fazzoletto Kim imbevuto con un po' di acqua deionizzata in questa scatola per evitare che il vetrino si secchi durante l'incubazione con l'anticorpo primario. Ora che l'anticorpo primario ha incubato per un'ora, rimuoveremo i vetrini e laveremo via l'anticorpo in eccesso con PBS.

Quindi, ancora una volta, lasciare scolare il liquido e immergere nel lavaggio con PBS. Eseguire nuovamente tre lavaggi di cinque minuti ciascuno. Dopo i tre lavaggi di cinque minuti, aggiungeremo l'anticorpo secondario al nostro tessuto nello stesso modo in cui abbiamo aggiunto l'anticorpo primario.

Quindi, utilizzando un volume sufficiente a coprire i tessuti, aggiungere l'anticorpo secondario, nel nostro caso un anticorpo caprino anti-coniglio, e riposizionare il vetrino nella camera controllata per l'umidità. Utilizziamo un anticorpo secondario biotinilato caprino anti-coniglio, essenziale quando si impiega il metodo A BC. Trasferiamo quindi il vetrino nella camera controllata per l'umidità e lasciamo incubare per un'ora.

Pertanto, mentre l'anticorpo secondario è in incubazione, dobbiamo preparare il reagente A BC. Utilizziamo il reagente A, B, C delle vector laboratories, proveniente dal kit di colorazione vector. Rimuovere il reagente a, primerizzarlo ed lasciare cadere tre gocce in 15 millilitri di PBS, avendo cura di non comprimere il tubo poiché le gocce devono essere dosate in modo preciso e di dimensioni specifiche.

Dopo che l'incubazione con l'anticorpo secondario è durata circa un'ora, si prendono i vetrini e si lavano nuovamente in PBS, proprio come si è fatto con l'anticorpo primario. Dopo tre lavaggi di cinque minuti ciascuno, si trasferiscono i vetrini in questo contenitore, aggiungendo il reagente A, B, C, che è stato preparato da 30 a 45 minuti prima. Si aggiunge quindi il reagente A, B, C nel contenitore, si ricoprono i vetrini e si lascia incubare per altri 30-45 minuti.

Dopo aver lasciato i vetrini in A, B, C per circa da 3 a 5 minuti, dobbiamo rimuovere la soluzione eccessiva di A, B, C. Pertanto, rimuovete semplicemente i vetrini e aggiungeteli alla soluzione di PBS. Dobbiamo ripetere questa procedura di lavaggio per tre volte in PBS, per cinque minuti ogni lavaggio.

Mentre i vetrini vengono lavati, preparo il substrato perossidasi DAB da Vector Laboratories. Prendo il tampone a pH 7,5 e aggiungo due gocce. Dopo il tampone a pH 7,5, prendo il reagente del substrato DAB e aggiungo due gocce di questo.

Anche in questo caso, la dimensione delle gocce è fondamentale, quindi non premere il flacone ma lasciare cadere semplicemente le gocce. Due gocce di tampone a pH 7,5. Aggiungere quindi quattro gocce del reagente substrato DAB, lasciandolo cadere allo stesso modo.

Desiderate inoltre aggiungere alla fine due gocce del reagente substrato perossido di idrogeno. Questo è l'aspetto che dovrebbe avere la miscela del reagente substrato DAB. Ora è pronta per essere aggiunta ai vetrini: rimuovete i vetrini e lasciate scolare semplicemente il PBS dai vetrini.

Nel tempo, il reagente DAB diventa sempre più marrone. Pertanto, a questo punto desideriamo aggiungerlo ai nostri vetrini. Prelevare un volume sufficiente a coprire i tessuti e aggiungerlo direttamente sui campioni di tessuto.

Quindi prelevare il volume appropriato e aggiungerlo direttamente sopra i campioni di tessuto, permettendo alla soluzione di svilupparsi: nel tempo, i campioni di tessuto dovrebbero assumere una colorazione più scura. Dopo l'aggiunta della soluzione DAB, è possibile osservare in questa sezione cerebrale dove il tessuto diventa marrone qui e qui. La colorazione marrone del DAB indica la regione contenente i neuroni dopaminergici del mesencefalo.

Dopo aver sviluppato i vetrini per un periodo compreso tra due e dieci minuti, è necessario aggiungerli all'acqua ghiacciata per arrestare la reazione. Lasciare semplicemente scolare la soluzione e immergere direttamente i vetrini nell'acqua ghiacciata. Dopo aver immerso i vetrini nell'acqua ghiacciata, portare il bagno al lavandino e far scorrere acqua fredda al suo interno per circa cinque minuti, assicurandosi che tutta la soluzione di DAB sia stata completamente rimossa da questo contenitore.

Pertanto, quando aggiungete il liquido nel lavandino, siate cauti a non far sì che il flusso colpisca il tessuto, ma piuttosto uno degli angoli, permettendo al liquido di semplicemente traboccare, in modo che i vostri tessuti non vengano disturbati dal flusso d'acqua. Dopo aver rimosso i vetrini dal lavaggio, è necessario eseguire una colorazione di contrasto. Perché potrebbe essere utile una colorazione di contrasto?

Beh, un motivo è che potrebbe essere necessario osservare la struttura del tessuto. Un altro è visualizzare tutte le cellule. A tale scopo, eseguiremo una colorazione di contrasto con ematossilina, che evidenzia i nuclei.

Quindi prendiamo i nostri vetrini, rimuoviamo il liquido in eccesso e immergiamoli una volta sola nella soluzione di Emat Ematina. Uno, tiratelo fuori e aggiungetelo direttamente nell'acqua. Dopo aver inserito i vetrini nell'acqua del rubinetto, prendete i vetrini e passateli sotto l'acqua, proprio come avete fatto in precedenza con il bagno di acqua ghiacciata.

Per il lavaggio dell'ematoxilina, lasciare scorrere semplicemente l'acqua corrente finché l'acqua all'interno del barattolo non diventa limpida. Dopo aver rimosso le nostre vetrini colorati dal contrasto dall'acqua, dobbiamo ri-deidratare i vetrini. Pertanto, dobbiamo farli nuovamente passare attraverso il gradiente di etanolo, ma in ordine inverso.

Quindi si effettua un lavaggio con acqua deionizzata, un lavaggio con etanolo al 30%, un lavaggio con etanolo al 50%, un lavaggio con etanolo al 70%, due lavaggi con etanolo al 95% e due lavaggi con etanolo al 100%, ciascuno della durata di due minuti. Rimuovere quindi i vetrini, asciugare il liquido in eccesso e immergerli direttamente nell'etanolo al 30%, lasciandoli in posa per due minuti. Dopo l'ultimo lavaggio con etanolo al 100%, occorre riposizionare i vetrini nello xilene.

Prendete nuovamente i vetrini, rimuovendo il liquido in eccesso, e poneteli nel primo xilene per cinque minuti. Saranno quindi tre lavaggi consecutivi in xilene, ciascuno della durata di cinque minuti. Ora siamo pronti per montare i nostri vetrini.

Quello che di solito faccio è prelevare, un minuto prima che i vetrini siano pronti, la soluzione per montaggio permanente con la mia pipetta Pasteur e lasciarla a riposo per circa un minuto prima di estrarre i vetrini dopo l'ultimo lavaggio con xilene, avendo cura di non inzuppare i guanti né bagnarli con xilene. Rimuoverli quindi con una pinzetta, prestando attenzione al lato su cui si trova il tessuto. Asciugare delicatamente l'eccesso di xilene con un fazzoletto Kim, facendo attenzione a non toccare il tessuto, ma pulendo con cautela solo agli angoli e ai bordi, in modo da permettere all'xilene di evaporare quasi completamente. È possibile lavorare su due vetrini prima che uno si asciughi del tutto.

Quindi, mentre state finendo di asciugare un vetrino, l'altro vetrino dovrebbe essere pronto per essere utilizzato. Ora dovete lavorare con essi prima che si asciughino completamente. Dovete quindi prendere il vostro perimount e tracciare una linea sottile accanto al vostro tessuto, avendo cura di non toccare il tessuto.

Rimuovere il Perimount prendendo il vetrino coprioggetto. Applicarlo con un angolo di 45 gradi e lasciarlo piegare verso il basso. Quindi far scivolare il vetrino coprioggetto, assicurandosi che il Perimount ricopra tutti i tessuti.

Quindi posizionatelo e premete delicatamente al centro per rimuovere tutte le bolle d'aria in eccesso. Lasciatelo asciugare mentre lavorate sul secondo campione; questo è il momento per esaminare i vetrini, anche se non effettivamente. Pertanto, dobbiamo lasciare asciugare il perma mount durante la notte prima di osservare i nostri vetrini.

In caso contrario, alla luce del microscopio, il montaggio permanente formerà bolle e rovinerà il campione. Ecco un'immagine delle nostre sezioni cerebrali dopo la colorazione con sostanze chimiche, anticorpo policlonale di coniglio diretto contro la tirosina idrossilasi. Ancora una volta, la colorazione bruna di DAB mostra la localizzazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo.

La controstain con ematina colora di blu tutti i nuclei in questo tessuto. Ho appena mostrato come colorare sezioni incluse in paraffina utilizzando il kit ABC di Vector Laboratories. Ora sarà necessario regolare le condizioni in base ai tipi di tessuto da colorare e agli anticorpi che si utilizzeranno.

In bocca al lupo per i vostri esperimenti.