Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il controllo genetico della formazione di traslocazioni mediante il ripiegamento a singolo filamento in cellule diploidi di lievito in gemmazione. Questo viene ottenuto innanzitutto inoculando colture con singole colonie di un genotipo specifico e coltivandole per tutta la notte. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'indurre la formazione simultanea di rotture a doppio filamento mediante l'endonucleasi Ho su due cromosomi, aggiungendo galattosio alle colture.

Successivamente, questi colture vengono diluite e seminate su terreni selettivi e non selettivi. L'ultimo passaggio consiste nel determinare la frequenza di traslocazione contando le colonie sviluppatesi sui terreni selettivi e non selettivi. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano il controllo genetico della formazione di traslocazioni da parte del singolo filamento, mediante variazioni nella frequenza di formazione di traslocazioni indotte da ho in ceppi di diverso genotipo.

Le implicazioni di questa tecnica riguardano le conseguenze dell'esposizione a radiazioni terapeutiche nei pazienti affetti da cancro, poiché la formazione di rotture a doppio filamento del DNA e di traslocazioni costituisce l'effetto principale di questo trattamento. Per iniziare la procedura di determinazione delle frequenze di traslocazione indotta, inoculare da 10 a 20 colture indipendenti di un millilitro di mezzo glicerolo-lattato Y in presenza di singole colonie del genotipo desiderato, quindi incubare le colture tutta la notte a 30 gradi Celsius su un agitatore rotante. Quando le colture hanno raggiunto la densità cellulare desiderata, aggiungere il 20% di galattosio alle colture fino a una concentrazione finale del 2%. La galattosio indurrà l'espressione dell'endonucleasi ho, che provocherà rotture a doppio filamento nell'allele *his3-δ5'* sul cromosoma tre e nell'allele *his3-δ3'* sul cromosoma 15; incubare per quattro ore a 30 gradi Celsius su un agitatore rotante.

Il passaggio successivo è fondamentale per il successo della procedura. Una diluizione e un’allestimento accurati delle colture sono essenziali. Se si ottengono frequenze di traslocazione sufficientemente riproducibili da permettere confronti statisticamente significativi tra ceppi di diverso genotipo, dopo quattro ore allestire su piastra la diluizione appropriata delle colture su mezzo privo di istidina, nonché su YPD, con circa da 100 a 200 colonie per piastra; incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.

Quando compaiono le colonie, è possibile determinare la frequenza di traslocazione. Le efficienze di semina prima e dopo l'induzione dell'espressione dell'endonucleasi ho indicheranno se la presenza o l'assenza di uno dei cromosomi traslocati influisce sulla capacità di sopravvivere alla formazione di rotture a doppio filamento (DSB). Tali frammenti una copia sia del cromosoma tre che del cromosoma 15 per determinare le efficienze di semina pre-induzione.

Prima di tutto, prelevare un'aliquote di cellule da ciascuna coltura notturna e determinare il numero di cellule contando con un emocitometro. Successivamente, utilizzare un'opportuna diluizione per piastrare circa da 100 a 200 cellule su YPD e incubare per due o tre giorni a 30 °C fino alla comparsa di colonie. Aggiungere il 20% di galattosio alle colture rimanenti fino a una concentrazione finale del 2% e incubare a 30 °C per quattro ore per determinare l'efficienza di piastramento post-induzione.

Prelevare un'aliquote di cellule da ciascuna coltura dopo quattro ore di induzione e determinare il numero di cellule mediante emocitometro. Seminare circa da 100 a 200 cellule su piastra utilizzando un'opportuna diluizione su YPD e incubare per due o tre giorni a 30 gradi Celsius fino alla comparsa di colonie. Una volta comparse le colonie sulle piastre, è possibile determinare l'efficienza di semina. Le clone portatrici di traslocazione putative possono essere analizzate mediante Southern blot.

Questa procedura utilizza DNA genomico preparato da una singola colonia ricombinante di hiss proveniente da ciascun esperimento indipendente; digerire circa quattro microgrammi di ciascun campione di DNA con l'endonucleasi di restrizione BAM H1, separare i frammenti digeriti con BAM H1 su un gel di agarosio allo 0,7% e quindi trasferirli su una membrana di nylon positivamente carica. Ibridizzare con una sonda marcata con P-32 ottenuta mediante priming casuale, utilizzando un clone genomico BMH1 di 1,8 chilobasi contenente il gene HIS3. Visualizzare i frammenti di DNA mediante autoradiografia o fosfoimaging. Un altro modo per analizzare le colonie presumibilmente portatrici di traslocazione è l'analisi cromosomica mediante blot.

I cromosomi vengono inizialmente preparati da ricombinanti hiss positivi e separati in un gel all'1% di aros in un campo elettrico omogeneo con clampaggio a contorno o CHEF a 14 gradi Celsius. Vengono utilizzati i seguenti parametri: primo blocco a 14 gradi Celsius, tempo di commutazione di 72 secondi e durata di 15 ore a sei volt per centimetro; secondo blocco a 14 gradi Celsius, tempo di commutazione di 122 secondi e durata di 11 ore a sei volt per centimetro. Al termine dell'elettroforesi, visualizzare i cromosomi colorando il gel con bromuro di AUM per 30 minuti, seguito da irradiazione con luce UV e successiva detenzione; trasferire quindi i cromosomi in una membrana carica positivamente mediante azione capillare.

In condizioni denaturanti, si effettua l'ibridazione con una sonda marcata con P 32 ottenuta mediante priming casuale, utilizzando un clone genomico di 1,8 chilobasi bam H one bam H one contenente il gene hiss. Il gene viene visualizzato sui cromosomi mediante autoradiografia o phosphor imaging. La frequenza delle traslocazioni cromosomiche può essere calcolata dividendo il numero di colonie fototrofiche all'istamina per il numero totale di cellule vitali determinato tramite semina su YPD.

In questo esempio, la frequenza di ricombinazione calcolata è di circa il 3%. Il saggio per le frequenze di traslocazione indotte da HO può essere eseguito utilizzando ceppi di diverso genotipo per confrontare le differenze nella capacità di riparare interruzioni a doppio filamento mediante singolo filamento. Un andamento come mostrato in questo grafico rappresentativo. Le frequenze di traslocazione ottenute sia in modo selettivo che non selettivo con l'omozigote nullo RAD51Δ erano statisticamente diverse da quelle ottenute utilizzando le condizioni corrispondenti con il ceppo di tipo selvatico, sia prima che dopo la piastratura induttiva.

I rendimenti sono determinati dividendo il numero totale di cellule formanti colonie vitali per il numero totale di corpi cellulari nella coltura, determinato tramite conta con emocitometro, come mostrato in questa tabella prima e dopo la semina post-induzione. I rendimenti non sono risultati significativamente diversi per le cellule di tipo selvaggio, il che suggerisce che la presenza o l'assenza di uno qualsiasi dei cromosomi traslocati non influisce sulla capacità di sopravvivenza. Formazione di DSB.

Le colture putative portatrici di traslocazione possono essere analizzate mediante analisi genomica con blot di Southern. Qui viene mostrata una rappresentazione grafica dei cromosomi rilevanti prima e dopo la formazione della traslocazione. Le dimensioni dei frammenti di restrizione contenenti le sequenze rilevanti, generati dalla digestione con BAM H uno del DNA genomico di ceppi parentali e ricombinanti e rivelati su membrane mediante ibridazione con una sonda di 1,8 chilobasi BAM H uno, sono indicate.

I suoi tre cloni genomici sono elencati in coppie di chilobasi per l'analisi mediante Southern blot. Il DNA genomico viene digerito con l'endonucleasi BMH1 e ibridato con una sonda per l'HIS3 marcata al P32 di 1,8 chilobasi per visualizzare questi frammenti diagnostici.

0,8 chilobasi HIS tre delta 201,7 chilobasi hiss tre delta tre prime 4 chilobasi T 3 15 5 chilobasi T 15 tre e 8 chilobasi hiss tre delta cinque prime frammenti. La corsia A è il diploide parentale. La corsia B è un ricombinante con traslocazione non reciproca hiss più e la corsia C è una traslocazione reciproca his più.

L'analisi cromosomica BLO ricombinante può essere utilizzata anche per esaminare le linee cellulari portatrici di traslocazioni. I cromosomi integri, preparati in tappi di agarosio, vengono separati mediante elettroforesi CHEF e il gel viene colorato con bromuro di iridio e visualizzato sotto luce UV. I cromosomi separati vengono quindi trasferiti su membrana di nylon e ibridati con una sonda di 1,8 chilobasi marcata con P 32.

Il suo tre sonde per visualizzare il cromosoma intatto di 1,1 megabasi, il cromosoma di traslocazione T 15 di 15,8 megabasi, il cromosoma di traslocazione T 3;15 di 0,6 megabasi e il cromosoma tre intatto di 0,3 megabasi. La corsia A è il progenitore dispiegato. La corsia B è A his più ricombinante con traslocazione non reciproca, e la corsia C è A his più ricombinante con traslocazione reciproca.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la frequenza di formazione di traslocazioni a seguito di molteplici rotture a doppio filamento indotte da ho.