Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da 'perossidativi' e 'ossidativo' Footprinting radicale ossidrile

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare come si piegano le molecole di RNA utilizzando l'impronta dei radicali idrossilici. Questo viene ottenuto mediante marcatura terminale, purificazione su gel e pre-piegamento dell'RNA, passaggi che garantiscono l'integrità conformazionale dell'RNA prima del successivo piegamento mediato dal magnesio. Successivamente, i reagenti di Fenton vengono mescolati per generare radicali idrossilici, in grado di scindere il filamento dell'RNA in base alla sua accessibilità al solvente. In seguito, i prodotti di scissione dell'RNA vengono separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide denaturante e visualizzati mediante autoradiografia.

Gli integrali delle bande vengono quantificati mediante un software di analisi semi-automatica basato sul footprinting. L'obiettivo finale è generare isoterme di ripiegamento che riflettano la formazione della struttura terziaria dell'RNA. Questo viene ottenuto scalando gli integrali delle bande normalizzati alla saturazione frazionaria.

Le isoterme possono successivamente essere adattate all'equazione di Hill. Il vantaggio principale dell'idrossi footprinting è che si ottiene informazione sulla struttura terziaria dell'RNA utilizzando sostanze chimiche poco costose, poiché a causa della maggiore attività, i radicali idrossilici di piccole dimensioni sono sonde ideali per distinguere tra nucleotidi accessibili al solvente e quelli sepolti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia strutturale dell'RNA.

Ad esempio, in che modo i ribosomi utilizzano gli ioni metallici per raggiungere la loro conformazione attiva? L'analisi mediante impronta del radicale idrossile può essere impiegata per comprendere i fondamenti della specificità e del riconoscimento dell'RNA. Oltre a rivelare informazioni sulla struttura terziaria dell'RNA, questo metodo può essere utilizzato per determinare i siti di legame precisi delle proteine su molecole di RNA o di DNA.

I principali ostacoli di questo metodo consistono nel prevenire il degrado del campione da parte delle ribonucleasi e nell'ottimizzare la concentrazione di ferro al fine di ottenere la quantità corretta di scissione dell'RNA. Inoltre, l'analisi dettagliata degli intervalli delle bande può risultare piuttosto complessa. Il principale vantaggio di questo video è aiutare il pubblico a comprendere le fasi di pianificazione e l'esecuzione corretta dell'esperimento di footprinting con radicali idrossilici. Prima di iniziare questo protocollo, preparare tutti i reagenti per il footprinting come descritto nel protocollo scritto.

In associazione a questo video, l'RNA può essere prodotto come DFO etichettati in posizione terminale e correlati, come descritto. Purificare l'RNA marcatto radioattivamente mediante elettroforesi su gel denaturante. Recuperare l'RNA purificato mediante due estrazioni consecutive del gel utilizzando acetato di sodio 0,3 molare.

Quindi precipitare l'RNA mescolando 0,5 millilitri della soluzione acquosa con un millilitro di etanolo. Incubare la miscela per un minuto su ghiaccio secco. Dopo aver centrifugato il campione, eliminare il soprannatante. Lavare il pellet di RNA con etanolo al 70%.

Rimuovere il soprannatante dopo un'ulteriore centrifugazione ed essiccare il pellet in vuoto. Successivamente, sciogliere i campioni di RNA purificati marcati con P 32. In 330 microlitri di buffer di reazione una volta, pipettare 30 microlitri della soluzione di RNA in un nuovo tubo di reazione.

Precipitare l'RNA con etanolo, quindi essiccare il pellet in vuoto; una volta essiccato, questo pellet può essere utilizzato per generare la scala di riferimento come descritto nella procedura scritta per denaturare la soluzione di RNA rimanente mediante riscaldamento a 95 gradi Celsius per due minuti. Portare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti e procedere con una breve centrifugazione per riportare il condensato in soluzione. Per iniziare l'esperimento di footprinting, preparare 27 provette per reazione, in numero sufficiente a riempire un gel elettroforetico da 30 pozzetti.

Dopo aver incluso i marcatori e il controllo digerito, determinare le concentrazioni finali di ioni magnesio e ferro in modo che siano equidistanti su una scala logaritmica, coprendo diversi ordini di grandezza intorno al punto medio della titolazione. La preparazione degli ioni magnesio in un buffer di reazione 1x è descritta separatamente nel testo. Incubare la soluzione di RNA e la soluzione di ioni magnesio a 50 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, mescolare 10 microlitri della soluzione di RNA con 90 microlitri della corrispondente quantità di soluzione di ioni magnesio e ferro.

Per raggiungere un volume finale di 100 microlitri, incubare ogni miscela per 30 minuti a 50 gradi Celsius. Successivamente, lasciare equilibrare le soluzioni a 25 gradi Celsius per un'ora mentre avviene il ripiegamento dell'RNA. Nel frattempo, immediatamente prima di avviare la reazione del footprinting con radicali idrossilici, preparare la miscela di reazione fantasma come descritto nel protocollo scritto.

Preparare la reazione di perossidazione pipettando due gocce di due microlitri ciascuna di ferro EDTA, sodio ascorbato e perossido di idrogeno nella parte superiore interna del tubo da reazione contenente la soluzione di RNA, in modo che le gocce non si tocchino. Avviare la reazione di footprinting mediante miscelazione vigorosa. Dopo 15 secondi, arrestare la reazione aggiungendo 300 microlitri di etanolo puro e freddo.

Ruotare le provette da tre a cinque volte. Infine, precipitare, lavare ed essiccare il pellet come eseguito in precedenza; in alternativa alla reazione ossidativa perossidativa, la reazione ossidativa di idrossilazione verrebbe eseguita aggiungendo cinque microlitri della miscela di reazione di Fenton appena preparata ai campioni. Incubare la reazione ossidativa per 30 minuti a 25 gradi Celsius.

Quindi aggiungere 300 microlitri di etanolo puro e freddo per arrestare la reazione e mescolare capovolgendo i tubi. Precipitare nuovamente. Lavare e asciugare il pellet al termine della reazione perossidativa o ossidativa.

Sciogliere i pellet di RNA essiccati in otto microlitri di colorante di carico per gel due. Verificare che l'RNA marcato con P 32 sia stato risospeso utilizzando un contatore Geiger; preparare un gel di sequenziamento denaturante all'8% di poliacrilamide seguendo protocolli standard. Utilizzando una pettina a 30 pozzetti, caricare i campioni, inclusi due campioni di riferimento e un controllo digerito.

Separare i frammenti di RNA a 60-75 watt per due ore e mezza. Esporre il gel essiccato a una schermata fosforica per tutta la notte. Scansionare la schermata fosforica con un sistema di imaging per autoradiografia senza pellicola.

Quindi trasferire il file dell'immagine del gel sul computer per l'analisi. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire Safa, un software open source per l'adattamento e la quantificazione di singole bande. Caricare la sequenza di RNA come file di testo con estensione .txt, seguito dall'immagine del gel come file con estensione .gel.

Definire le corsie e regolare le intensità delle bande. Quindi scegliere una corsia di ancoraggio ed eseguire un allineamento del gel assegnando le bande ai nucleotidi in riferimento alla scala di digestione dell'RNA T uno. Quantificare le intensità delle bande e utilizzare la funzione di normalizzazione/divisione tramite grafico a colori per normalizzare e assegnare i residui potenzialmente invarianti.

Salvare l'output come file di testo. SFA genera un foglio di calcolo contenente colonne, che rappresentano le corsie del gel, e righe che rappresentano i singoli integrali delle bande corrispondenti al frammento di RNA. Innanzitutto, i siti di protezione che mostrano un cambiamento evidente nella accessibilità al solvente devono essere identificati confrontando il profilo di protezione derivato dal campione senza ioni magnesio con il profilo relativo alla concentrazione finale di ioni magnesio.

Più basso è il valore, maggiore è la protezione del nucleotide dall'attacco dei radicali idrossilici e viceversa. Successivamente, creare curve di transizione dell'intensità delle bande, di singoli nucleotidi o gruppi di nucleotidi in funzione della concentrazione di ione magnesio, utilizzando un formato foglio elettronico; scalare individualmente queste transizioni alla funzione di saturazione frazionaria come descritto nella parte testuale del presente protocollo. Come passaggio finale, adattare i dati all'equazione di Hill.

Questa analisi scala la transizione alla saturazione frazionaria, determina il punto medio della transizione e fornisce una verifica fenomenologica della presenza di un andamento sigmoideo. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di esperimenti di impronta con radicali idrossilici su RNA P quattro P sei. Le isoterme sono state derivate da gel di sequenziamento analizzati mediante Safa e successivamente adattate come descritto nella sezione di analisi.

L'immagine del gel indica che il taglio di fondo è minimo e che è possibile l'assegnazione di un singolo nucleotide grazie a bande ben definite nella corsia T. La frammentazione dell'RNA indotta dai radicali idrossilici è nettamente superiore al livello di fondo. La transizione da ioni magnesio bassi ad alti è selettivamente associata a una diminuzione dell'intensità di bande singole e di gruppi di bande, indicando la formazione dell'RNA.

La protezione della struttura terziaria si riferisce a singoli nucleotidi o gruppi di nucleotidi contigui il cui taglio modifica contemporaneamente le intensità delle bande, quantificate e normalizzate mediante analisi saffer. Il risultato è un grafico termico che visualizza il grado di protezione nei confronti dei radicali idrossilici. La transizione cromatica descrive la variazione di accessibilità in seguito all'aggiunta di ferro magnesiaco: dal bianco al rosso si indicano nucleotidi più accessibili, mentre dal bianco al blu si indicano nucleotidi più protetti.

Ogni grado di ombreggiatura è associato a un valore numerico, che può essere rappresentato come una curva di protezione e analizzato mediante un modello di legame come l'equazione di Hill. In questo esempio, la costante di dissociazione all'equilibrio associata alla protezione da 1 5 3 a 1 5 5 è approssimativamente il doppio del valore corrispondente della protezione da 1 6 3 a 1 6 4. Questo esperimento di impronta con radicali idrossilici può essere eseguito in un giorno e mezzo se effettuato correttamente.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di indossare guanti e camice da laboratorio per evitare contaminazioni da RNA. Inoltre, la concentrazione finale di ferro dipende dal sistema sperimentale. Pertanto, si raccomanda di eseguire un esperimento di risposta alla dose prima della footprinting, seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'impronta del radicale idrossile risolta nel tempo, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, in quale momento critico le molecole di RNA raggiungono una conformazione mal ripiegata o attiva dopo il loro sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale per esplorare interazioni terziarie intermolecolari e anche intermedie degli acidi nucleici.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la formazione della struttura terziaria delle molecole di RNA. Non dimenticare che caate e lo stadio di fosforo sono pericolosi; sono raccomandate precauzioni come l'uso di guanti e occhiali protettivi, oltre all'utilizzo di schermi in plexiglass durante l'esecuzione di questa procedura.