Visualizzazione dei Vascolare Ca ^{2 +} Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il segnale di calcio vascolare innescato dalle specie reattive dell'ossigeno, o ROS, derivate da segnali paracrini. Questo viene ottenuto innanzitutto visualizzando le ROS mediante coloranti sensibili all'ossidazione in macrofagi attivi. Le ROS possono inoltre essere visualizzate nelle cellule endoteliali utilizzando sensori fluorescenti basati su plasmidi.

Procedere quindi alla visualizzazione simultanea di macrofagi attivati marcati con cell tracker rosso e cellule endoteliali marcate con fluoro quattro in un modello di co-coltura. Infine, misurare il segnale del calcio nelle cellule endoteliali innescato dai ROS derivati dai macrofagi, utilizzando un sistema di imaging confocale.

Questi risultati possono dimostrare i livelli di ROS in modo indipendente e valutare contemporaneamente la mobilitazione del calcio intracellulare indotta dai ROS derivati dalla Peregrine. Questo metodo consente la valutazione simultanea di due molecole di segnalazione diverse che intimamente provocano una risposta vascolare e un contesto patofisiologico simulato. Due ricercatori post-dottorato nel mio laboratorio, Karthik e Raj, illustreranno la procedura sulle misurazioni di ROS e calcio e sulle interazioni tra cellule endoteliali e macrofagi.

Coltivare macrofagi derivati dai monociti di topo su piatti da 35 millimetri con fondo in vetro. Quindi stimolare le cellule con agonisti del recettore di tipo Toll e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius. Per la visualizzazione del citosol.

Aggiungere il colorante sensibile all'ossidazione ai ROS e incubare le cellule per 20 minuti. A questo punto, visualizzare le cellule su un palchetto microscopico a temperatura controllata di un sistema di imaging confocale. In alternativa, per visualizzare i ROS mitocondriali in cellule attivate dai TLR, aggiungere l'indicatore del superossido mitocondriale e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Come controllo negativo, trattare le cellule con PBS o DMSO come controllo positivo. Trattare le cellule con antimicina due millimolare. Procedere quindi a visualizzare tutte le cellule sul palchetto controllato in temperatura di un sistema di imaging confocale.

Utilizzando il software ImageJ, analizzare tutti i dati delle immagini. Il sensore fluorescente rileva in modo altamente specifico concentrazioni submicromolari di perossido e, in base all'espressione nei mammiferi, il design del vettore di espressione può essere mirato al citoplasma o ai mitocondri. Mediante elettroporazione, creare linee stabili di cellule endoteliali microvascolari polmonari di topo che esprimono in modo appropriato il plasmide Hyper.

Per favorire la crescita delle colonie, piastrare le cellule a bassa densità in TMEM completo e incubare per 48 ore; sostituire quindi il mezzo con mezzo di coltura completo integrato con un antibiotico selettivo. Selezionare le clone con la percentuale più elevata di cellule iperpositive e amplificare la coltura per generare linee stabili iperpositive in esperimenti individuali. Seminare le cellule su coprivetrini rivestiti con gelatina 0,2% e coltivare per tutta la notte fino a raggiungere una confluenza dell'80%.

Ora attivare le cellule con ligandi del TLR e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius. Per la rilevazione delle ROS citoplasmatiche, montare i coprivetri delle cellule su una camera da coltura adelo. Aggiungere un millilitro di soluzione salina bilanciata pre-riscaldata e posizionare la camera su un palco termoregolato del sistema di imaging confocale.

Registrare le variazioni di fluorescenza nelle cellule per la rilevazione dei mitocondri.ROS. Includere un controllo positivo con due micromolari di antimicina A. Quindi preparare i vetrini delle cellule trattate per la microscopia confocale. Eseguire l'analisi delle immagini utilizzando il software ImageJ.

Iniziare con cellule endoteliali coltivate fino a una confluenza dell'80% su coprioggetti in vetro rivestiti di gelatina per la visualizzazione e la misurazione delle variazioni di calcio intracellulare. Incubare le cellule con il colorante fluorescente fluo-4 AM a temperatura ambiente per 30 minuti per minimizzare la perdita di colorante; lavare quindi le cellule con soluzione di imaging sperimentale contenente probenecide. Montare ora i coprioggetti in una camera per cellule Adelo contenente 800 microlitri di soluzione di imaging sperimentale preriscaldata e posizionare le cellule su un palco microscopico a temperatura controllata del sistema di imaging confocale in un tubo separato.

Utilizzare 500 nanogrammi per millilitro di cell tracker red C-M-T-P-X per 15 minuti per etichettare la popolazione di macrofagi in esame, lavare le cellule e risospendere i pellet in 200 microlitri di soluzione sperimentale per imaging. Aggiungere ora i macrofagi etichettati sulle cellule endoteliali caricate con flu oh 4:00 AM nell'assemblea della camera per microscopia confocale e registrare la fluorescenza verde e rossa ogni tre secondi per 10 minuti.

In questo esperimento, le cellule J 7 74 0.1 sono state trattate con ligandi del TLR due, tre e quattro per sei ore. Le immagini confocali rappresentative mostrano un aumento del ROS citosolico misurato mediante DCF. In modo interessante, la fluorescenza rossa di mitoSOX indica un aumento simile del ROS mitocondriale.

Queste variazioni di fluorescenza sono quantitative. Pertanto, i risultati devono essere normalizzati ed espressi come variazione relativa rispetto al trattamento; il segnale dell'antimicina A conferma un controllo positivo per la produzione di ROS mitocondriali. Questa figura mostra immagini dei livelli di perossido endoteliale, citosolico e mitocondriale in iper citosolico o iper mito D stably espressi.

MP ECS stimolati con agonisti del TLR. La quantificazione della variazione della fluorescenza media dimostra un aumento della fluorescenza iper citoplasmatica e iper mitocondriale dopo sei ore di stimolazione in un sistema di co-coltura. Per valutare il segnale di ROS di Peregrine, macrofagi mirin freschi isolati sia da topi di tipo selvaggio che da topi GP 91 Fox null sono stati attivati con un microgrammo per millilitro di LPS per sei ore.

I macrofagi sono stati marcati in rosso con C-M-T-P-X e aggiunti ai flu verdi quattro.Caricati. MPM ecs. In modo interessante, i macrofagi attivati da LPS isolati da topi di tipo selvaggio hanno innescato una rapida e ampia mobilitazione del calcio negli ECS MPM rispetto ai macrofagi provenienti da topi GP 91 Fox null.

Sebbene il tentativo di LI preveda questa procedura, è importante ricordare che sia il prolungato scaricamento sia l'esposizione al laser possono portare all'autossidazione del DCF. È fondamentale evitare lo sbiancamento fotoindotto dell'iper citocromo e dell'iper D mitrale. Una volta padroneggiata, la misurazione del RA in macrofagi così come in cellule endoteliali può essere eseguita in sette ore se effettuata correttamente.