Monitoraggio delle proteine con a stato solido Nanopori
2 dicembre 2011
Un metodo di utilizzo allo stato solido nanopori per monitorare la non-specifico di assorbimento delle proteine su una superficie inorganica viene descritta. Il metodo impiega il resistivo impulsi principio, consentendo l'assorbimento di essere sondato in tempo reale e al livello di singola molecola. Poiché il processo di assorbimento delle proteine singolo è lontano dall'equilibrio, proponiamo l'impiego di matrici parallele di nanopori sintetici, permettendo per la determinazione quantitativa del primo o
L'obiettivo generale di questa procedura è creare nanopori in membrane artificiali per l'utilizzo in studi sull'assorbimento delle proteine. Questo viene ottenuto praticando nanopori in una membrana di nitruro mediante un microscopio elettronico a scansione (STEM). Successivamente, il nanoporo viene inserito in una camera e bagnato con una soluzione ionica.
In modo che il liquido formi un ponte da un lato del nanoporo all'altro per rendere il nanoporo pronto per gli esperimenti. Viene applicata una tensione ai suoi capi e si può osservare un passaggio di corrente ionica attraverso di esso. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere la proteina alla camera del nanoporo.
L'osservazione finale di blocchi a lunga durata nella corrente ionica attraverso il nanoporo rivela l'assorbimento di proteine sui lati del nanoporo. Ciao, sono Dave Wicki. Sono uno studente laureato del Dipartimento di Fisica della Syracuse University.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'assorbimento di proteine su superfici inorganiche, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le interazioni tra proteine e acidi nucleici, la spettroscopia di singole molecole e lo studio di molecole in spazi confinati. Iniziare portando lo strumento a una tensione di accelerazione.
Successivamente, inserire una griglia con finestra in nitruro di silicio SPI nel portacampioni per microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Pulire la griglia con plasma di ossigeno per 30 secondi per rimuovere i detriti. Prima di caricare il campione, inserire il portacampioni nel microscopio elettronico a trasmissione e attendere il raggiungimento del vuoto.
Utilizzando la modalità TEM in campo chiaro, individuare la finestra di nitruro, un quadrato luminoso sul programma grezzo. Assicurarsi che il TEM sia correttamente allineato. Successivamente, allineare e mettere a fuoco il campione.
Ora impostare il sistema in modalità STEM e utilizzare un rilevatore off-axis per acquisire un'immagine del campione e verificarne l'allineamento. Se presente, regolare il monocromatore su un valore basso, consentendo una corrente elettronica più elevata disponibile per la foratura. Selezionare la dimensione del spot appropriata per praticare il nanoporo in base al diametro della sonda elettronica.
Con il gambo allineato. Utilizzare il BROGRAM per mettere perfettamente a fuoco la membrana di nitruro alla magnificazione richiesta. Se si verifica qualsiasi movimento del campione, oscurare il fascio di elettroni e attendere che il campione si stabilizzi.
Questo può richiedere fino a un'ora. Una volta raggiunta la stabilità, posizionare la sonda elettronica sul campione e iniziare a forare il nanoporo. Forare un nanoporo con un microscopio elettronico a trasmissione richiede pazienza e precisione.
È un processo in cui il nitruro viene gradualmente dissipato sotto una sonda a fascio di elettroni. È importante mantenere la sonda elettronica direttamente sopra il sito di foratura e confermare che il nanoporo sia completamente perforato. Prima di rimuovere il campione dal microscopio elettronico a trasmissione, controllare periodicamente il campione eseguendo una scansione con il rilevatore acceso.
Se il campione subisce un leggero spostamento, regolare la posizione della sonda elettronica in modo che sia centrata sul nanoporo. Quando il grammo della zona di interesse (ROI) è a fuoco, la pellicola di nitruro lampeggiante scomparirà. Quando il nanoporo si forma con il grammo roky fuori fuoco, la frangia del bordo sfilacciato è visibile.
Acquisire l'immagine del nanoporo con la sorgente termica spenta ed eseguire un profilo di intensità dell'immagine. Il diametro del nanoporo può essere stimato a partire dalla regione più scura del profilo. Il fascio di elettroni può essere utilizzato per ingrandire il nanoporo, se necessario.
Quando ha il diametro richiesto. Passare alla modalità TEM con il monocromatore impostato sulla configurazione standard. Utilizzare la microscopia elettronica a trasmissione in campo chiaro per confermare la dimensione dei pori.
Iniziare preparando la soluzione salina disgasata. Sottoporre la soluzione a vuoto e sottoporla a sonificazione in bagno per 20 minuti. Posizionare delicatamente il chip in nitruro di silicio contenente il nanoporo, molto fragile, in un becher Pyrex da 10 millilitri. Successivamente, in una cappa, posizionare il becher su un piastra riscaldante.
Pulire con estrema attenzione il chip Nanopore con la soluzione di piranha. In primo luogo, aggiungere tre millilitri di acido solforico al contenitore utilizzando una pipetta di vetro. In secondo luogo, aggiungere con cautela un millilitro di perossido di idrogeno concentrato all'acido solforico.
Si prega di adottare tutte le precauzioni. Lasciare in ammollo il chip nanoporo per 10 minuti. Quindi, utilizzando una pipetta di vetro, rimuovere la soluzione piranha dal becher e smaltirla correttamente.
Successivamente, riempire il becher con acqua deionizzata degasata. Utilizzando una pipetta di vetro pulita, svuotare il becher dell'acqua e ripetere questo lavaggio almeno cinque volte. Con pinze pulite, rimuovere il chip nanoporo e asciugarlo mediante leggera aspirazione.
Una volta asciutto, sigillare immediatamente il chip nanoporo nella camera. Il chip può essere fissato nella camera mediante anelli O-ring o sigillante in silicone. Riempire la camera con soluzione di cloruro di potassio.
Collegare gli elettrodi in argento, cloruro d'argento alla camera. Gli elettrodi possono essere preparati immergendo un filo di argento nella candeggina per tutta la notte. Applicare un potenziale transmembrana attraverso gli elettrodi e monitorare la risposta di corrente utilizzando un amplificatore per patch clamp.
In modalità voltage clamp, costruire una curva corrente-tensione a partire dalle misurazioni. La curva dovrebbe essere altamente lineare. Quando si utilizza cloruro di potassio uno molare, la conduttanza della nanoporo deve corrispondere al suo diametro.
Se il nanoporo non mostra una curva IV lineare, la conduttanza è troppo bassa o la corrente aperta del nanoporo non è stabile. Ciò indica che il nanoporo non è correttamente inserito e la procedura di lavaggio con piha deve essere ripetuta. È essenziale assicurarsi che il fluido sia all'interno del nanoporo.
Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, la corrente ionica attraverso il nanoporo mostrerà un rumore molto elevato e il transito delle proteine nel nanoporo sarà drasticamente ridotto. Iniziare aggiungendo un campione purificato della proteina di interesse nel bagno a terra della camera. Attendere che il campione si diffonda completamente.
Applicare una tensione con polarità opposta alla carica totale della proteina in esame. Una tensione applicata di 200 millivolt dovrebbe essere sufficientemente elevata da permettere l'osservazione. La maggior parte degli eventi relativi alle proteine analizzate apparirà come deflessioni transitorie della corrente rispetto alla linea di base.
Se non viene osservato alcun segnale, aumentare la concentrazione della proteina nella camera. Tensioni più elevate migliorano il rapporto segnale/rumore e nitruro. Le nanopori possono sopportare diverse volt.
Le assorbimenti proteici appariranno come variazioni di lunga durata della corrente di base del Nanoporo. I risultati tipici per nanopori allo stato solido saranno i seguenti. La corrente del poro aperto dovrebbe essere altamente stabile.
Le caratteristiche IV del nanoporo dovrebbero essere altamente lineari. In cloruro di potassio 1 M e fosfato di potassio 10 M a pH 7,4, l'inclinazione di un adattamento lineare alla curva IV fornirà la conduttanza unitaria del nanoporo. La conduttanza ha una relazione diretta con il diametro del nanoporo e dovrebbe corrispondere all'equazione.
Questo valore dovrebbe corrispondere entro il 30%. Se il valore è troppo piccolo, il poro probabilmente non è stabilizzato dall'aggiunta della proteina. Dovrebbero verificarsi eventi rapidi: l'assorbimento della proteina determina una riduzione della corrente di lunga durata. Alcune proteine sono altamente labili e subiscono trasformazioni strutturali all'interno del poro.
In questo caso, la caduta di tensione di lunga durata sarà accompagnata da fluttuazioni rapide. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre nanopori allo stato solido utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione in scansione e sfruttando l'assorbimento della proteina SA. Non dimenticare che lavorare con la soluzione piranha può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come operare in una cappa aspirante indossando guanti, un camice da laboratorio e un grembiule chimico, quando si esegue questa procedura.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un protocollo per la fabbricazione di nanopori allo stato solido in membrane di nitruro di silicio e per il loro utilizzo nello studio dell'adsorbimento proteico a livello di singola molecola. Il metodo sfrutta la tecnica del polso resistivo per monitorare le interazioni proteiche con le superfici dei nanopori, fornendo informazioni sulle dinamiche di adsorbimento proteico e permettendo applicazioni più ampie nella spettroscopia di singola molecola e negli studi molecolari in spazi confinati.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biophysica
- Nanotecnologia
- Analisi di singole molecole
Sfondo
- I nanopori allo stato solido sono utilizzati per analizzare acidi nucleici, il disfacimento delle proteine e il legame di ligandi a livello di singola molecola.
- La tecnica del polso resistivo consente la rilevazione senza etichette delle interazioni tra analiti e nanopori monitorando le variazioni della corrente ionica.
- L'adsorbimento delle proteine sulle pareti dei nanopori assume un'importanza crescente con la riduzione delle dimensioni dei dispositivi microfluidici.
- Questo protocollo può essere adattato per diversi film sottili e superfici funzionalizzate.
Scopo dello studio
- Creare e utilizzare nanopori allo stato solido per saggi rapidi del legame proteico a film di nitruro.
- Monitorare in tempo reale gli eventi di adsorbimento proteico mediante misurazioni della corrente ionica.
- Fornire una piattaforma versatile per lo studio delle interazioni proteina-superficie in diverse condizioni.
Metodi Utilizzati
- Perforazione di nanopori in membrane di nitruro di silicio mediante microscopio elettronico a trasmissione in scansione (STEM).
- Pulizia e preparazione delle chip con nanopori mediante plasma di ossigeno e soluzione piranha.
- Assemblaggio della chip con nanopori in una camera e riempimento con soluzione ionica (ad esempio, cloruro di potassio).
- Applicazione di un potenziale transmembrana e monitoraggio della corrente ionica mediante un amplificatore per patch clamp.
- Introduzione di campioni proteici e osservazione di blocchi della corrente indicativi di eventi di adsorbimento.
Risultati principali
- Realizzazione con successo di nanopori con diametri controllati, confermata da immagini TEM e misure di conduttanza.
- Caratteristiche corrente-tensione (IV) stabili e lineari in nanopori correttamente bagnati.
- Rilevamento di blocchi di corrente transitori e a lunga durata corrispondenti al frazionamento e all'adsorbimento di proteine.
- Capacità di distinguere tra eventi rapidi e adsorbimento prolungato in base alle firme di corrente.
Conclusioni
- Il protocollo consente la creazione e l'uso affidabile di nanopori allo stato solido per studi sull'adsorbimento di proteine.
- Fornisce un metodo sensibile e privo di marcatori per monitorare interazioni a livello di singola molecola con superfici inorganiche.
- L'approccio è adattabile a diverse proteine, superfici e condizioni sperimentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I saggi con nanopori allo stato solido consentono un monitoraggio diretto e senza etichette dell'adsorbimento proteico a livello di singola molecola, affrontando sfide fondamentali nella comprensione delle interazioni proteina-superficie nel settore della ricerca biofarmaceutica&Questa capacità è sempre più vitale poiché la miniaturizzazione dei dispositivi amplifica l’impatto dell’adsorbimento proteico su piattaforme microfluidiche e analitiche. L’integrazione di analisi basate su nanopori supporta una previsione più affidabile e la riduzione dei rischi meccanicistici nei primi stadi dei processi di scoperta e sviluppo di saggi.
Applicazioni strategiche nella biofarmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi delle interazioni proteina-superficie rilevanti per la verifica di ipotesi terapeutiche.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico rivelando la dinamica di adsorbimento in diverse condizioni di soluzione.
- Facilita la validazione funzionale del comportamento delle proteine su superfici inorganiche e funzionalizzate.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un saggio rapido e quantitativo per l'analisi del legame proteico a film sottili di nitruro e ad altri film sottili.
- Offre letture riproducibili e prive di marcatori, adatte alla standardizzazione tra diverse piattaforme.
- Permette di preparare sistemi validati per lo screening di composti successivi e per flussi analitici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette l'esplorazione della stabilità proteica e dell'adsorbimento in ambienti confinati rilevanti per lo sviluppo di dispositivi.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica caratterizzando le interazioni proteina-materiale.
- Fornisce informazioni predittive sul comportamento delle proteine in sistemi microfluidici e diagnostici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio basato su nanopori si inserisce nel continuum dalla scoperta iniziale allo sviluppo del saggio, fornendo dati fondamentali per l'identificazione dei composti promettenti e la progettazione di dispositivi preclinici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi e la chiarificazione meccanicistica delle interazioni proteina-superficie.
- Screening: Permette una valutazione riproducibile e quantitativa dell'adsorbimento proteico per la preparazione dei saggi.
- Analisi: Fornisce misurazioni della corrente a livello di singola molecola e firme degli eventi di adsorbimento per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Si allinea allo sviluppo di dispositivi preclinici modellando il comportamento delle proteine in ambienti confinati e rilevanti per i dispositivi.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a una vasta gamma di proteine, superfici e condizioni sperimentali per un'ampia utilità in R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi proteina-materiale.
- Valore operativo: Fornisce saggi standardizzati, scalabili e riproducibili a livello di singola molecola.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi in fase avanzata nello sviluppo di dispositivi e saggi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati proteici e delle piattaforme per dispositivi in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di nanopori e nell'analisi della corrente a livello di singola molecola.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per microscopia elettronica e per tecnica del patch clamp.
- Richiede protocolli rigorosi di pulizia e standardizzazione per garantire la riproducibilità.
- È adattabile a diversi film sottili e superfici funzionalizzate, come supportato dalla realizzazione di nanopori.
- Le precauzioni di sicurezza sono fondamentali durante la manipolazione di reagenti per la pulizia pericolosi.
