Individuazione di partner proteine interagenti mediante Tandem Affinity Purification
25 febbraio 2012
Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.
L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un metodo noto come purificazione in affinità in tandem per isolare i partner di legame delle proteine. Salve, sono dLAN Bailey della sezione di Virologia dell'Imperial College di Londra. Nel nostro laboratorio, studiamo le interazioni tra virus e ospite per diversi membri della famiglia dei virus.
Identificare le proteine che interagiscono con altre proteine cellulari o virali è un ottimo punto di partenza per studiare l'interazione tra il virus e il suo ospite durante l'infezione. In questo video, illustrerò un approccio che utilizziamo nel nostro laboratorio, la purificazione in tandem o marcatura TAP. Il marcatore TAP usato in questo studio è un marcatore N-terminale costituito da due unità di proteina G e da un peptide legante lo streptavidina.
Questi sono separati da una sequenza di clivaggio della proteasi TEV che consente l'eluzione specifica della proteina esca. In questo esempio, la EIF4E murina è situata all'estremità C di questo costrutto di fusione. Il protocollo di marcatura TAP è una procedura in sei passaggi.
Dopo la trasfezione e la generazione di linee cellulari, le cellule vengono indotte a esprimere la proteina con il tag prima di essere lisate in un tampone di lisi delicato. Vengono utilizzati due passaggi di purificazione per affinità e due soluzioni specifiche per purificare l’analita e qualsiasi partner interagente potenziale al fine di generare le linee cellulari. Le cellule HEC 293 devono essere trasfettate con il vettore di espressione P met four che codifica per.
Le cellule contenenti la proteina esca marcate con il tag vengono quindi selezionate utilizzando cento microgrammi per millilitro di idromicina B. Poiché il plasmide viene mantenuto in forma episomica, non è necessario isolare cloni specifici. Dieci piastre di cellule confluenti vengono indotte mediante trattamento con cloruro di cadmio 10 micromolare per 16 ore prima di essere raschiate nel mezzo di coltura. Le cellule sospese vengono quindi trasferite in provette da 15 ml e le cellule vengono pellettizzate mediante centrifugazione.
Queste cellule vengono quindi lavate tre volte con PBS ghiacciato prima di essere infine pellettate. Nel secondo passaggio, la lisi cellulare avviene sciogliendo le cellule in cinque millilitri di tampone di lisi freddo mediante pipettaggio ripetuto, lasciando quindi in ghiaccio per cinque minuti. Per garantire una lisi efficiente, le cellule vengono quindi passate attraverso un ago sottile e smussato con siringa e sottoposte a congelamento-scongelamento.
Il surnatante risultante viene distribuito in provette da 1,5 ml e le cellule e i detriti vengono rimossi mediante centrifugazione. È importante notare che la dimensione del pellet risulta notevolmente ridotta dopo questo passaggio di centrifugazione. I surnatanti del lisato vengono quindi raccolti in una provetta Falcon da 15 ml e filtrati attraverso un filtro da 0,45 micrometri per rimuovere eventuali detriti residui.
Devono essere prelevati aliquote da 50 microlitri di questo lisato per le analisi successive. Questo campione è indicato come campione uno. Passaggio tre, legame all'Aeros di IgG coniglio.
In questa fase del protocollo, i marcatori proteina G vengono immunoprecipitati mediante le microsfere di IgG da coniglio. Per distribuire le microsfere aros, rimuovere la punta finale del pipettaggio. Ciò consente di evitare danni alle microsfere.
Ri-sospendere delicatamente la soluzione di aro IgG da coniglio agitando il flacone prima di trasferire gli aro in un tubo da 15 ml. Lavare gli aro tre volte in buffer di lisi freddo utilizzando una centrifugazione a bassa velocità per chiarificare le perle a ogni passaggio. Le perle di IgG da coniglio pellettizzate dovrebbero essere visibili dopo la centrifugazione.
Dopo ogni passaggio, rimuovere con attenzione il tampone senza disturbare le perle. Al termine dell'ultimo lavaggio, aggiungere il lisato filtrato e chiarificato alle perle raggruppate e incubare per tre ore o durante la notte. È preferibile a quattro gradi C utilizzando un agitatore rotante.
Dopo l'immunoprecipitazione, centrifugare i bead di agarosio ed eliminare il surnatante per l'analisi successiva. Se necessario, è possibile utilizzare una punta fine per rimuovere qualsiasi liquido residuo da questa provetta. Questo surnatante è il campione due, passaggio quattro, scissione con proteasi TEV.
In questo passaggio, l'esca viene scissa dai marcatori proteina G. Questo passaggio permette la scissione specifica della proteina esca, fungendo efficacemente da fase di eluizione dall'immunoprecipitazione con IgG di coniglio su aros. Preparare la miscela di scissione TEV e aggiungerla alle perle aros utilizzando una punta ape con l'estremità rimossa, trasferire questa miscela in una provetta microcentrifuga silanizzata e capovolgere per sospensionare le aros prima dell'incubazione notturna a quattro gradi C; prelevare un'aliquota della reazione di scissione TEV per l'analisi.
Questo è il campione tre. L'incubazione notturna sul miscelatore rotante dovrebbe permettere alla reazione TEV di procedere quasi a completamento. Passaggio cinque, legame per immobilizzare le perle di streptavidina.
In questo passaggio, l'esca Cleve e qualsiasi eventuale partner di legame vengono purificati per affinità dalla soluzione. Innanzitutto, centrifugare la reazione di scissione TEV contenente le perle di aros IgG di coniglio. Per raccogliere le perle di aros, rimuovere un OTT del supernatante chiarificato per l'analisi.
Questo è il campione quattro. Rimuovere con attenzione tutto il sovranatante rimanente, che contiene la proteina bersaglio, trasferendolo in un tubo fresco. Utilizzare nuovamente una pipetta fine.
Centrifugare i campioni per rimuovere tutto il soprannatante possibile. Conservare le perle di IgG di coniglio legate per le analisi successive. Questo è il campione cinque.
Per evitare danni alle perle di streptavidina, rimuovere la punta da un pipetto monouso. Sospendere delicatamente le perle e trasferirne un'aliquote in un tubo silanizzato. Lavare le perle con streptavidina nel buffer S, chiarificando mediante centrifugazione a bassa velocità.
Dopo ogni lavaggio, rimuovere con attenzione il tampone. Le perline Strept adin sono molto piccole e possono essere facilmente spostate anche utilizzando una pipetta fine.
Preparare i consigli per i pet. Dopo aver lavato le perle di streptavidina, aggiungere il sopranatante della reazione di scissione da TEV a queste perle e incubare la reazione per tre ore o durante la notte a quattro gradi C, utilizzando un miscelatore rotante.
Dopo l'incubazione, centrifugare per raccogliere i bead di streptavidina e rimuovere il sopranatante. Questo è il campione sei. Da notare.
La proteina Beit è ora associata alle perle rimanenti nel tubo. Lavare le perle di streptavidina contenenti la proteina esca con il buffer di lisi. Per rimuovere eventuali proteine contaminanti aggiuntive, rimuovere la soluzione di lavaggio rimanente dalle perle e lasciarle sul ghiaccio.
Passaggio sei, eluizione con biotina. In questo passaggio, la biotina viene aggiunta ai microsferini di streptavidina. L'interazione tra la biotina e i microsferini di streptavidina sposta l'esca, che ritorna in soluzione.
Aggiungere la soluzione di biotina direttamente alle perle e capovolgere per mescolare. Incubare la reazione a quattro gradi C per tre ore oppure tutta la notte utilizzando un miscelatore rotante. Centrifugare la miscela di biotina e raccogliere con attenzione il soprannatante in un tubo nuovo. Questo è il campione finale di EIT, indicato come campione sette.
Le perle di streptavidina rimanenti costituiscono il campione otto. A causa della bassa concentrazione proteica, questo eluato finale deve essere concentrato prima dell'analisi. Questo risultato si ottiene utilizzando colonne centrifughe con cutoff per bassi pesi molecolari, riducendo il volume mediante centrifugazione e monitorando regolarmente il processo.
Questo campione concentrato può essere suddiviso e analizzato su gel SDS-PAGE mediante colorazione con Coomassie e con argento. Se i campioni devono essere analizzati mediante spettrometria di massa, si consiglia di utilizzare gel commerciali prefabbricati. Le singole bande possono quindi essere estratte e le proteine identificate mediante spettrometria di massa.
In questo caso, l'esca era murina, EIF per la proteina E. Il vantaggio del sistema tap è che consente di esprimere la proteina di interesse in una particolare linea cellulare e, a seconda della linea cellulare di interesse, offre anche la possibilità di esprimere la proteina a livelli relativamente bassi. È possibile decidere di farlo, e tutte le modifiche post-traduzionali e la localizzazione vengono mantenute, consentendo spesso la purificazione del complesso nativo.
Panoramica
La purificazione dell'affinità in tandem è una tecnica potente per identificare i partner di legame delle proteine. Questo metodo è stato applicato al fattore di inizio della traduzione eIF4E per co-precipitare i fattori della cellula ospite coinvolti nell'inizio della traduzione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Studi sulle interazioni proteiche
- Biologia cellulare
Sfondo
- La purificazione in affinità in tandem (TAP) è un metodo utilizzato per isolare complessi proteici.
- Il marcatore TAP è costituito dalla proteina G e da un peptide legante la streptavidina.
- Questa tecnica consente l'eluzione specifica delle proteine esca.
- Comprendere le interazioni proteiche è fondamentale per lo studio della dinamica virus-ospite.
Scopo dello studio
- Isolare e identificare le proteine che interagiscono con il fattore di inizio della traduzione eIF4E.
- Studiare l'interazione tra proteine virali e proteine dell'ospite durante l'infezione.
- Dimostrare l'adattabilità del metodo TAP a diverse proteine.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione di cellule HEC 293 con un vettore di espressione marcato con TAP.
- Lisi cellulare e purificazione utilizzando perle di IgG da coniglio e streptavidina.
- Clivaggio con proteasi TEV per l'eluzione specifica delle proteine bersaglio.
- Multipli passaggi di lavaggio e centrifugazione per garantire la purezza dei campioni.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di eIF4E e dei suoi partner interagenti.
- Dimostrazione dell'efficienza del metodo TAP nell'identificazione di complessi proteici.
- Identificazione di potenziali fattori ospite coinvolti nell'inizio della traduzione.
- Convalida dell'adattabilità del metodo ad altre proteine.
Conclusioni
- La purificazione a doppia affinità è un approccio efficace per lo studio delle interazioni proteiche.
- Il metodo può essere applicato a diverse proteine cellulari e virali.
- Comprendere queste interazioni fornisce informazioni sui meccanismi di patogenesi virale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'identificazione delle interazioni proteina-proteina rappresenta un passo fondamentale nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico nei programmi di scoperta nell'industria biotecnologica e farmaceutica. La purificazione in affinità in tandem (TAP) consente l'isolamento di complessi proteici nativi in condizioni quasi fisiologiche, favorendo un'associazione affidabile con l'obiettivo e la mappatura dei percorsi biologici. Questo approccio riduce i falsi positivi nei test iniziali e migliora l'affidabilità predittiva nelle campagne di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'interrogazione di ipotesi terapeutiche isolando i partner di legame diretti e indiretti di proteine bersaglio come eIF4E.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli identificando membri noti del complesso come eIF4G, 4EBP-1, eIF4A e la proteina legante poli-A.
- Valore predittivo: Migliora la selezione del portafoglio distinguendo gli interagenti specifici dal rumore di fondo mediante controlli con solo il marcatore TAP.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, catturando complessi endogeni con modifiche post-traduzionali preservate.
- Valore operativo: Consente la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso passaggi definiti di eluizione (proteasi TEV e biotina) e protocolli di lavaggio rigorosi.
- Scalabilità: Supporta il riutilizzo della piattaforma in diverse linee cellulari mediante espressione plasmidica episomale, evitando la generazione di linee clonali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la rilevanza per le malattie studiando eIF4E nell'avvio della traduzione dipendente dal cap, un percorso alterato nel cancro e nelle infezioni virali.
- Allineamento Preclinico: Collega le scoperte a una riduzione meccanicistica del rischio identificando interattori secondari che chiariscono il contesto del percorso.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Informa le decisioni di proseguire o meno chiarendo il meccanismo del bersaglio e l'integrità del complesso prima dell'ottimizzazione del capostipite.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
TAP si inserisce nel percorso di scoperta che va dai saggi di interazione con il bersaglio alla validazione preclinica, in particolare per bersagli in cui l'integrità del complesso nativo è fondamentale per la funzione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi e la chiarificazione di vie metaboliche isolando complessi associati a eIF4E in condizioni di espressione inducibile.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio fornendo risultati quantitativi tramite bande identificabili mediante spettrometria di massa dopo separazione tramite SDS-PAGE.
- Analisi: Permette l’analisi comparativa tra condizioni sperimentali grazie a passaggi di eluizione specifici che riducono il legame non specifico.
- Ricerca traslazionale: Si collega all’allineamento di biomarcatori identificando fattori dell’avvio della traduzione coinvolti nella segnalazione oncogenica.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile per diverse proteine bersaglio grazie alla progettazione modulare del marcatore TAP e al sistema di espressione episomale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli target, riduzione dell'ambiguità meccanicistica e preservazione di complessi nativi.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità tra linee cellulari e proteine bersaglio.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla caratterizzazione precoce dei complessi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su dati di interattoma validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in tecniche di clonazione molecolare, trasfezione transitoria e purificazione per affinità.
- Presuppone l'accesso a infrastrutture per centrifugazione, agitatori rotanti, inibitori delle proteasi e spettrometria di massa.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la progettazione dei marcatori, i protocolli di induzione e la stringenza dei lavaggi.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse proteine bersaglio, livelli di espressione e localizzazione subcellulare.
- Comprende limitazioni pratiche come il possibile interferenza del marcatore e la necessità di ottimizzare i tempi di induzione e le condizioni di lisi.
