Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

L'obiettivo generale del seguente esperimento è illustrare l'uso del glicosio per la deglicosilazione enzimatica e l'analisi della glicosilazione N- e O-legata su un glicoproteina modello. Questo viene ottenuto trattando una glicoproteina con PGA's F o con una miscela di deglicosilazione proteica. Inoltre, alla miscela di deglicosilazione proteica è stato aggiunto un mix di esoglicosidasi aggiuntive, che a volte aiutano a rimuovere zuccheri altrimenti resistenti.

Illustreremo questo metodo utilizzando una glicoproteina modello, la gonadotropina corionica umana ricombinante beta, o HCG beta, sottoposta successivamente a SDS-PAGE, seguita da colorazione con Kumasi blue e da un metodo di colorazione specifico per gli zuccheri. Vengono utilizzati Pro Q Emerald 300 per analizzare la glicosilazione D. Si ottengono risultati sul campione di HCG beta, che mostrano come l'HCG beta sia eterogeneamente glicosilata e contenga molteplici glicoforme, in base alle differenze nella migrazione proteica con e senza trattamento glicosidico e al segnale ridotto nella colorazione con ProQ man mano che i glicani vengono rimossi in modo successivo.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi mediante spettrometria di massa, è la sua semplicità, l'utilizzo di attrezzature di laboratorio comuni e l'adeguatezza per il neofita in campo glicobiologico. Questo metodo permette di rispondere a domande fondamentali nel campo della glicobiologia, come ad esempio se la mia proteina sia glicosilata. Per iniziare la desglicosilazione enzimatica, scongelare i tamponi forniti nel kit di desglicosilazione proteica.

Mescolare accuratamente le provette e mantenerle a temperatura ambiente. Posizionare le fiale contenenti l'enzima sul ghiaccio, sciogliere il contenuto della fiala di HCG beta in 600 microlitri di acqua distillata e mantenere sul ghiaccio. Dopo aver preparato un millilitro di buffer 1 XG sette diluendo la soluzione madre 10 x in acqua distillata, utilizzare 25 microlitri per diluire 0,5 microlitri di PGA's f.

Preparare la miscela di esoglicosidi combinando due microlitri ciascuno dei quattro esoglicosidi. Successivamente, aggiungere HCG beta e tampone denaturante per glicoproteine 10x in sette provette PCR numerate come indicato nel protocollo scritto, chiudere le provette e mescolare delicatamente. Denaturare le proteine nel termociclatore incubando per 10 minuti a 94 gradi Celsius, seguiti da un mantenimento a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso le provette dal termociclatore, centrifugare per eliminare qualsiasi condensa visibile; aggiungere quindi a ciascuna provetta di reazione i reagenti rimanenti secondo il protocollo scritto. Chiudere le provette PCR utilizzando nuovi tappi.

Quindi, mescolare i tubi picchiettando delicatamente quattro volte dopo aver centrifugato il contenuto, quindi posizionare i tubi nel termociclatore e incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Successivamente, raffreddare i campioni a quattro gradi Celsius. Per preparare la SDS-PAGE, preparare un buffer di caricamento SDS riducente fresco 3x.

Con DTT, aggiungere 12,5 microlitri del buffer di caricamento SDS riducente 3x preparato a ciascun campione, chiudere le provette con tappi nuovi e agitare delicatamente le provette per mescolare. Incubare le provette in un termociclatore a 94 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare a 4 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, caricare 30 microlitri di ciascun campione e 10 microlitri del marcatore proteico su un gel tri-glicina 10-20%, conservando il resto di ciascun campione.

Eseguire l'elettroforesi sul gel a 130 volt finché il fronte D non è vicino al fondo del gel. Al termine dell'elettroforesi, rimuovere il gel dallo stampo e posizionarlo in una piccola scatola di plastica con una quantità sufficiente di colorante blu di Coomassie per coprire completamente il gel. Lasciare il gel in colorazione per un'ora con agitazione delicata dopo averlo colorato.

Lavare tre volte per 30 minuti. In 50 millilitri di soluzione di detersione, acquisire le immagini utilizzando un trasluminatore a luce bianca o uno scanner. In alternativa, il gel può essere essiccato tra fogli di cellophane.

In un apparato, far correre il resto di ciascun campione e un marcatore proteico su un gel Tri glycine al 10-20% mentre il gel è in esecuzione. Sciogliere il reagente ProQ emerald in DMF e preparare le soluzioni di fissaggio, lavaggio e ossidazione per la colorazione seguendo il manuale fornito con il kit. Al termine dell'elettroforesi, rimuovere il gel dallo stampo e collocarlo in una scatola di plastica.

Fissare il gel aggiungendo 100 millilitri della soluzione fissante preparata. Lasciare il gel tutta la notte a temperatura ambiente con agitazione delicata il giorno successivo. Lavare il gel con 100 millilitri della soluzione di lavaggio preparata per 10-20 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata, ripetendo il lavaggio una seconda volta con soluzione fresca.

Successivamente, ossidare i carboidrati incubando il gel con agitazione delicata per 30 minuti in 25 millilitri della soluzione ossidante preparata, seguire l'incubazione con due ulteriori lavaggi mentre il gel viene lavato. Preparare una soluzione fresca di colorante ProQ Emerald 300 aggiungendo 500 microlitri della soluzione del reagente ProQ Emerald 300 a 25 millilitri del tampone di colorazione fornito nel kit. Colorare il gel incubandolo nella soluzione di colorante preparata in condizioni di buio con agitazione delicata per 90-120 minuti successivamente alla colorazione del gel.

Ripetere i due passaggi di lavaggio come descritto in precedenza. Quindi acquisire le immagini con un transilluminatore UV a 300 nanometri. Come passaggio finale, confrontare le immagini del gel colorato con kumasi con quelle del gel colorato con ProQ Emerald.

Le variazioni nella migrazione delle proteine dopo la desglicosilazione enzimatica possono essere osservate confrontando il campione di controllo con il trattamento F di PGA. Per rimuovere i glicani N e con il trattamento con la miscela di desglicosilazione per rimuovere i glicani N e O, non si osserva ulteriore riduzione della dimensione dopo la digestione con glicosidasi aggiuntive. Oltre al cambiamento di massa, le bande diventano più nitide man mano che i glicani vengono rimossi.

Una banda che corre al di sotto del marcatore di 17 chilodalton probabilmente rappresenta il polipeptide beta della HCG completamente deglicosilato. Le corsie da cinque a sette mostrano le bande corrispondenti alla glicoforma. Altre bande potrebbero derivare da una deglicosilazione incompleta o da proteine multiple non identificate presenti nel campione del beta HCG.

Il reagente verde smeraldo ossida e colora tutti i glicani presenti in una molecola proteica. Pertanto, l'intensità del segnale diminuisce quando la beta HCG viene deglicosilata enzimaticamente. Il segnale residuo nelle corsie tre e quattro indica la presenza di motivi glicanici resistenti agli enzimi utilizzati.

Il glicosato aggiuntivo viene utilizzato nella corsia quattro. Rimuovere alcuni residui di zucchero in eccesso. La migrazione delle proteine è la stessa, ma si può osservare una leggera riduzione nell'intensità della colorazione.

Le frazioni di zucchero resistenti non erano presenti in tutte le specie proteiche. Alcune bande non sono state rilevate con Emerald Green, indicando che erano state ampiamente desglicosate. Ulteriori dati sostengono la conclusione che l'HCG beta è glicosilata in modo eterogeneo. La banda inferiore nella corsia due è debole nell'immagine di Emerald Green.

Mentre la banda superiore della corsia due è intensa, indicando che numerosi gruppi GLYCAN sono ancora presenti, questi dati supportano la conclusione che l'HCG beta ricombinante espressa in cellule di topo contiene molteplici forme glico-legate a causa dell'eterogeneità intrinseca della glicosilazione. Dopo questo procedimento, possono essere eseguiti altri metodi come la spettrometria di massa per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: qual è il tasso di occupazione? Qual è l'estensione della glicosilazione o quale la struttura fine dei glicani?

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la glicosilazione per la desglicosilazione enzimatica e l'analisi dei glicani legati a NNO su glicoproteine. La scelta del metodo di rilevamento può risultare difficile perché le tecniche di colorazione delle proteine sono utili soltanto se la deglicosilazione provoca un significativo spostamento della massa molecolare rispetto ad altre proteine.

Abbiamo osservato migrazioni anomale dopo la desglicosilazione e abbiamo scoperto che qualsiasi modifica nella migrazione costituisce un'indicazione del fatto che la proteina è stata desglicosilata.