Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

L'obiettivo generale del seguente esperimento è conferire proprietà aderenti ai batteri al fine di facilitarne la separazione da mezzi liquidi. Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando una curli sintetica per aggirare la complessa regolazione genetica ed abilitare la produzione semplice e massiccia di polimeri adesivi. Come secondo passaggio, i batteri aderenti vengono visualizzati e quantificati su policarbonato, permettendo una rapida stima dell'efficienza del dispositivo sintetico.

Successivamente, i batteri aderenti vengono visualizzati su vetro mediante microscopia confocale. Per osservare direttamente il biofilm e ottenere informazioni sulla sua struttura, i risultati ottenuti mostrano un aumento significativo dell'adesione nella ceppa che ospita il dispositivo sintetico, basato sia sulla misurazione percentuale dell'adesione che su osservazioni microscopiche. Il principale vantaggio dell'approccio della biologia sintetica rispetto ai metodi esistenti, come il clonaggio convenzionale, è che è possibile ottenere molto rapidamente un costrutto che contiene soltanto i geni strettamente necessari con i segnali appropriati.

Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della biorisanazione, ad esempio affrontando la sfida della rimozione di batteri carichi di metalli dai rifiuti radioattivi. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà perché richiede conoscenze di base sui segnali genetici regolatori e sulla gestione delle banche dati. La dimostrazione visiva si concentrerà sulla quantificazione e sulla visualizzazione del biofilm, poiché questi due passaggi sono particolarmente difficili da apprendere a causa della fragilità dei biofilm.

Il primo passo per progettare il carrone sintetico consiste nel determinare l'organizzazione genetica dei geni curly e nel localizzare i loro segnali endogeni di trascrizione e traduzione. Questo viene effettuato utilizzando database specializzati come REON DB o eco gene. Il passo successivo è selezionare i cinque geni assolutamente necessari per la sintesi di curly, CSGB e CSGA che codificano i monomeri della fibra, e C-S-G-E-C-S-G-F e CSGG che codificano il complesso di secrezione curly, estrarre le sequenze scelte dal database in formato fasta; la gestione dei dati e un'analisi preliminare in silico verranno eseguite con il software clone manager, poiché il cluster C-S-G-G-F-E è in senso antisenso nel genoma di e coli.

Questa sequenza deve essere convertita nella sua controparte complementare inversa. Utilizzare le operazioni degli strumenti di gestione del clone: invertire la molecola, incollare la sequenza C-S-G-E-F-G dietro la sequenza C-S-G-B-A utilizzando la funzione di ligazione. Successivamente, aggiungere il promotore appropriato PRCN davanti alla sequenza iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

Il locus RCN codifica una pompa FLX, RCNA, responsabile della detossificazione del nichel e del cobalto, e il suo regolatore metallico associato RCNR. In assenza di cobalto o nichel, il repressore RCNR si lega alla sequenza RCNR sul DNA e impedisce l'attivazione completa della trascrizione dei geni a valle. Se la concentrazione intracellulare di cobalto o nichel aumenta, il legame del cobalto o del nichel alla proteina RCNR impedisce il fissarsi del repressore al promotore e l'attività trascrizionale di P-R-C-N-A aumenta, mettendo sotto controllo del promotore i cinque geni ricci selezionati.

Si prevede che le PRCN ricciute siano sovraprodotte in presenza di cobalto e nichel. Successivamente, ottimizzare i segnali trascrizionali aggiungendo un sito di legame per il ribosoma perfetto, o RBS, davanti al primo ATG della sequenza di DNA CS gba e un secondo RBS perfetto davanti alla sequenza C-S-G-E-F-G. Per rispettare gli standard I GMs, il dispositivo deve essere affiancato da un prefisso bio-brick standard contenente siti di restrizione per ECO R uno e X-bar uno, e da un suffisso contenente siti di restrizione per SPE uno e PST uno, al fine di facilitare ulteriori assemblaggi.

La parte del bio brick potrebbe non contenere alcun sito di riconoscimento per ECO R uno, PST uno, SPE uno e X-bar R uno. Pertanto, questi siti sono stati eliminati mediante mutazioni silenti; l'analisi in silico con enzimi di restrizione ha rivelato un sito PST uno nella sequenza CSGA, un sito PST uno nella sequenza RCNR e un sito ECO R uno nel gene CSGE. Questi siti sono stati modificati attraverso mutazioni silenti.

Una volta completata la progettazione dell'opor sintetico, eseguire una simulazione di traduzione utilizzando il software clone manager. Utilizzare il programma di allineamento di sequenza blast per verificare l'omologia perfetta tra le proteine curly di tipo selvatico e le proteine codificate dall'on sintetico per iniziare questa procedura per ogni pozzetto di una piastra in polistirene a 24 pozzetti con due millilitri di mezzo minimo M 63 contenente glucosio 0,2%, inoculando ciascun pozzetto con 10 alla sesta cellule di una coltura batterica notturna. Far crescere i batteri a 30 gradi Celsius per 18-48 ore senza agitazione; ogni colonna della piastra a 24 pozzetti rappresenta una modalità.

La quantità corretta di cobalto e antibiotico viene aggiunta secondo necessità. Le prime tre righe vengono utilizzate per quantificare i batteri aderenti A mediante la media delle tre ripetizioni. L'ultima riga rimasta viene utilizzata per visualizzare il biofilm mediante colorazione con violetto di cristallo dopo 18-48 ore; recuperare il soprannatante contenente le cellule planctoniche da ogni pozzetto delle prime tre righe della piastra a 24 pozzetti e trasferire il soprannatante in un tubo per emolisi.

Risciacquare attentamente ogni pozzetto con un millilitro di mezzo M 63 ed aspirare la soluzione di lavaggio nel tubo per emolisi insieme al sopranatante iniziale. Questo pool è indicato come cellule in movimento, denominato S. Il fondo dei pozzetti nella piastra microtitolazione è ricoperto da cellule aderenti. Per recuperare il biofilm, aggiungere un millilitro di M 63 in ciascun pozzetto.

Scrapiate bene con la punta della pipetta, quindi aspirate e rilasciate più volte, trasferendo la frazione di biofilm in un nuovo tubo emolitico. Vortexare il tubo per 15 secondi. Raccogliere la frazione di biofilm in tubi emolitici.

Questo pool rappresenta le cellule aderenti alla superficie, denominate B. Trasferire 200 microlitri della frazione di supernatante e biofilm dai tubi di emolisi in una piastra a 96 pozzetti. Stimare il numero di batteri aderenti alla superficie e di batteri mobili a partire dalla densità ottica a 600 nanometri. La percentuale di adesione per ciascuna modalità viene calcolata utilizzando la formula B per 100 diviso tre volte S più B. Per visualizzare il biofilm, esclusivamente nell'ultima riga della piastra a 24 pozzetti, eliminare le cellule planctoniche da quei pozzetti.

Aggiungere un millilitro di M 63 in ogni pozzetto per risciacquare il biofilm sviluppato sul fondo della piastra. Lasciare asciugare la piastra scoperta per un'ora a 80 gradi Celsius; dopo un'ora, aggiungere 100 microlitri di violetto di cristallo al 20% in ciascun pozzetto per due minuti, seguiti da numerosi risciacqui con acqua. Per questo protocollo è necessario un chassis fluorescente.

Un ospite adatto per il plasmide portatore del gene sintetico di curli è il ceppo e coli SCC uno, che esprime costitutivamente la proteina fluorescente verde senza differenze osservabili rispetto al ceppo parentale MG 1 16 55. Trasformare il ceppo ospite con un plasmide puck 57 portatore del gene sintetico di curli per ottenere il ceppo S 23. Trasformare il ceppo ospite con un plasmide di controllo puck 18 per ottenere il ceppo di controllo.

Coltivare per tutta la notte le precolture dei ceppi S 23 e S 24 a 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, in mezzo M 63 integrato con glucosio e ampicillina, aggiungere 20 millilitri di mezzo M 63 in una piastra di Petri e quindi inoculare 15 millilitri di mezzo M 63 in piastre di Petri con 100 microlitri delle precolture. Aggiungere la concentrazione appropriata di cobalto e non dimenticare il controllo negativo senza cobalto.

Inserire tre coprioggetti rettangolari in vetro in ciascuna piastra di Petri. Incubare le piastre durante la notte a 30 gradi Celsius senza agitazione. I batteri possono essere visualizzati direttamente al microscopio fluorescente nei giorni successivi.

È importante evitare l'essiccazione del campione, quindi i seguenti passaggi devono essere eseguiti con attenzione ma rapidamente. Rimuovere ogni coprioggetto dalle piastre di Petri e drenarlo con cura. Pulire delicatamente la faccia inferiore con un piccolo bastoncino di cotone imbevuto di etanolo al 70% per rimuovere tutti i residui batterici prima dell'osservazione al microscopio confocale.

Posizionare il vetrino coprioggetto su un vetrino portaoggetto con la faccia superiore ricoperta dal biofilm disposto con la faccia verso l'alto. Il biofilm viene quindi ricoperto con un vetrino coprioggetto più grande, che viene fissato al vetrino portaoggetto con della vernice.

Rovesciare l'assemblaggio in modo che il biofilm si trovi ora sulla faccia inferiore. Posizionare l'assemblaggio sotto il microscopio a laser confocale in questo esperimento. Viene utilizzato un microscopio a laser confocale Zeiss LSM five 10 meta all'interno della piattaforma CT micro.

Selezionare l'obiettivo ad immersione in olio da 40 volte. Utilizzare le seguenti impostazioni: eccitare la GFP a 488 nanometri e raccogliere la fluorescenza batterica nell'intervallo compreso tra 500 e 600 nanometri. Utilizzare l'obiettivo ad immersione in olio da 40 volte per acquisire le immagini.

In modalità confocale a scansione laser, acquisire le strutture tridimensionali complessive dei biofilm dalla superficie solida fino all'interfaccia con il mezzo di crescita, utilizzando un passo di un micron.

Eseguire proiezioni tridimensionali con un software maus, determinare lo spessore del biofilm mediante l'analisi del valore medio di C lungo sezioni longitudinali statistiche. La quantificazione del biofilm, volumi biologici, può essere estratta da stack Z confocali. Le capacità di adesione di e coli ingegnerizzati per sovraprodurre curly in risposta a metalli possono essere valutate mediante metodi semplici.

Ad esempio, la colorazione con violetto cristallino su piastre Irene lucidate da 24 pozzetti consente una rapida visualizzazione della formazione di biofilm sul fondo di ciascun pozzetto, come mostrato dalla differenza nell'intensità del colore viola. Sembra che il ceppo di tipo selvaggio sia meno aderente rispetto al ceppo ingegnerizzato. Un metodo quantitativo consiste nel misurare le percentuali di adesione su polistirene dei ceppi di tipo selvaggio e ingegnerizzati con diverse concentrazioni di cobalto.

I risultati presentati in questo grafico rivelano che la percentuale di adesione del ceppo ingegnerizzato è 1,5 volte superiore rispetto a quella del ceppo di tipo selvatico in assenza di cobalto. Inoltre, è stato osservato un significativo potenziamento dell'adesione in presenza di concentrazioni crescenti di cobalto: nei mezzi con concentrazioni di cobalto di 25 micromolari o 50 micromolari, le percentuali di adesione delle cellule ingegnerizzate raggiungono rispettivamente il 30% e il 40%. Le capacità adesive possono essere confrontate anche mediante microscopia utilizzando batteri marcati con GFP coltivati su vetrini; osservazioni al microscopio a fluorescenza episcopica di batteri verdi su sfondo nero rivelano che il ceppo ingegnerizzato forma un biofilm, mentre il ceppo di tipo selvatico forma soltanto microcolonie indicate dalle frecce.

L'analisi mediante microscopia confocale fornisce una visione d'insieme della struttura tridimensionale del biofilm. Le ricostruzioni della vista dall'alto sono mostrate nei pannelli A e quelle della vista laterale nei pannelli B. I risultati confermano che il ceppo ingegnerizzato è più aderente e forma un biofilm più denso e spesso rispetto al ceppo selvatico. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante verificare attentamente il disegno sperimentale, ad esempio per esplorare il potenziale di bioremediazione di ceppi modificati di e coli o di occus ants nel contesto di acque reflue radioattive.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare un gene sintetico utilizzando un software di gestione del clone e di come quantificare rapidamente l'espressione di ceppi batterici. Non dimenticare che lavorare con geni sintetici e organismi geneticamente modificati può essere estremamente pericoloso. Tali attività devono essere svolte nel rispetto delle normative vigenti e precauzioni come l'autoclavaggio dei batteri trasformati devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.