Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è integrare un costrutto di DNA desiderato nel cromosoma batterico in un locus predeterminato. Questo risultato si ottiene mediante un protocollo di accoppiamento che coinvolge quattro ceppi batterici ingegnerizzati. Il ceppo ricevente possiede una sequenza di atterraggio composta da un gene di resistenza alla specinomicina e dal gene della beta-glucuronidasi di e. coli, delimitati da siti ATP, integrati nel suo cromosoma.

Il ceppo donatore P JH one 10 possiede un plasmide contenente siti B che delimitano un gene codificante per una proteina fluorescente rossa, e un gene di resistenza agli antibiotici. Il ceppo donatore PJC due possiede un plasmide contenente l'integrasi sito-specifica del fago streptomiceti C 31 sotto il controllo del promotore LAC. Il quarto ceppo MT 616 fornisce i geni di trasferimento necessari per la coniugazione, il trasferimento di plasmidi da cellula a cellula, che porta alla creazione di trans nei ceppi riceventi.

Acquisizione dei due plasmidi necessari per lo scambio di cassette mediato dall'integrasi. Lo scambio della cassetta donatrice dal plasmide PJ H one 10 con i marcatori della cassetta del sito di atterraggio sul cromosoma determina la perdita dei marcatori del sito di atterraggio, SPR e UIDA, e il mantenimento della cassetta donatrice RFP e GMR nel transimmigrante risultante. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la ricombinazione omologa, è la semplicità e l'efficienza del protocollo.

È inoltre trasferibile a un'ampia gamma di batteri. Il ceppo accettore utilizzato in questo video è un ceppo di S. milli coltivato due giorni prima della procedura di accoppiamento per la creazione di transintegrine; inoculare, a partire da una singola colonia, in cinque millilitri di terreno TY con spectinomicina. Incubare il ceppo di S. milli a 30 gradi Celsius per due giorni con agitazione, il giorno precedente la procedura di accoppiamento inoculare ciascuno dei seguenti ceppi di E. coli in cinque millilitri di terreno liquido LB integrato con l'antibiotico appropriato: DH5α contenente il plasmide di espressione dell'integrasi nel terreno con tetraciclina, MT616, il mobilizzatore intermedio con cloramfenicolo e DH5α contenente il plasmide del cassetto donatore nel terreno con gentamicina. Incubare i tre ceppi di E. coli tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione costante per preparare le cellule alla procedura di accoppiamento. Trasferire 1,5 millilitri di ciascuna delle quattro colture in un tubo e centrifugare a 17.000 × g per 30 secondi per raccogliere il pellet cellulare, eliminare il terreno e risospendere ciascun pellet cellulare in un millilitro di cloruro di sodio sterile allo 0,85%. Centrifugare nuovamente i tubi dopo aver eliminato il surnatante; risospendere ciascun pellet in 100 microlitri di cloruro di sodio sterile allo 0,85% utilizzando una pipetta. Applicare singolarmente 10 microlitri di coltura lavata per ciascun ceppo su una piastra di agar TY semplice.

Questi punti sono punti di controllo. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di ciascun ceppo, escludendo l'e coli DH cinque alfa contenente Pjc due, in un tubo sterile e mescolare aspirando e dispensando più volte. Piastrare 120 microlitri di questa miscela su una piastra di agar TY semplice. Questo punto è il controllo negativo senza integrasi.

Infine, aggiungere 40 microlitri di ciascuno dei quattro ceppi in un tubo sterile, mescolare e depositare 160 microlitri di questa miscela sulla stessa piastra di agar TDY. Questa colonia rappresenta il punto di accoppiamento per lo scambio di cassette mediato dall'integrasi.

Posizionare la piastra in una cappa a flusso laminare e lasciare asciugare le colonie per circa 20 minuti. Sigillare la piastra e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte, il giorno successivo al tracciamento secondo il protocollo di accoppiamento. Le due colonie di controllo e la colonia di accoppiamento IMCE su piastre di agar TY supplementate con streptomicina e gentamicina.

Il ceppo accettore S milli presenta una mutazione che conferisce resistenza ad alto livello alla streptomicina, necessaria per il calcolo dell'efficienza IMCE. Ri-sospendere circa un quarto del punto di coniugazione IMCE in 500 microlitri di cloruro di sodio sterile allo 0,85%. Eseguire diluizioni seriali decimali fino a 10 alla meno sette. Piastrare le diluizioni dalla 10 alla meno due alla 10 alla meno cinque su piastre di agar TY addizionate con streptomicina, gentamicina e xgl per selezionare i trasconjuganti. Piastrare le diluizioni dalla 10 alla meno tre alla 10 alla meno sette su piastre di agar TY addizionate con streptomicina e xgl per selezionare sia i trasconjuganti che i potenziali ceppi recettori. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni per determinare il numero totale di recettori.

Visualizzare la trasduzione di RFP in luce verde e attraverso un filtro rosso; calcolare la percentuale di efficienza IMCE come CFU di trasduttanti rispetto ai CFU dei ricettori totali. Circa la metà dei trasduttanti avrà subito uno scambio reale, diventando bianchi e insensibili dopo tre giorni di incubazione su Ty integrato con streptomicina e gentamicina. Non dovrebbe esserci crescita nei seguenti ceppi di controllo: controllo senza integrasi, s. millilatte UW 2 27, controllo e. coli MT 616, controllo e. coli DH cinque alpha contenente P JH uno 10 e controllo e. coli DH cinque alpha contenente PJC due. Al contrario, l'IMCE prelevato dal punto di coniugazione dovrebbe mostrare una crescita confluente nella prima striatura e numerose colonie nella seconda striatura. Queste due immagini successive mostrano sospensioni di risospensione di un'analisi al dieci alla meno due del punto di coniugazione su agar TY-streptomicina xgl e su agar TY-streptomicina-gentamicina xgl.

Le colonie blu sono ricombinanti singoli. Mentre le colonie bianche sono integrine trans che hanno subito un vero scambio di cassetta quando osservate alla luce verde e attraverso un filtro rosso, queste tendono a non mostrare fluorescenza nel saggio di accoppiamento diluito di due ordini di grandezza della sospensione di resospensione su agar TY strept cin xgl. Al contrario, la diluizione 10 alla meno due della sospensione di resospensione del punto di accoppiamento su agar Ty streptomicina Gentamicina Xgl mostra due livelli di fluorescenza.

Le colonie più luminose corrispondono a colonie blu e presentano un'espressione più elevata di RFP, presumibilmente a causa di una lettura attraverso il promotore LAC presente nel vettore. Le colonie meno luminose corrispondono a colonie bianche, che hanno subito uno scambio reale del cassette e contengono RFP con il solo promotore immediato, senza lettura attraverso il promotore LAC. Queste tendenze suggeriscono che gli isolati dovrebbero anche essere sensibili alla spectinomicina.

L'efficienza dell'integrazione in trans, espressa come percentuale di batteri trans-immigrati rispetto al numero totale di riceventi, dovrebbe essere nell'intervallo dello 0,5%. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la coniugazione batterica, impiegando i nostri ceppi ingegnerizzati, per inserire costrutti di DNA nel cromosoma batterico.