Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Questo articolo video descrive un procedimento per ottenere profili di glicosilazione di 20 diversi glicoproteine in un campione di siero di paziente affetto da carcinoma epatocellulare, utilizzando un microarray di anticorpi chimicamente bloccato. Inizialmente, specifici anticorpi per le glicoproteine vengono stampati direttamente su vetrini per microarray e i glicani degli anticorpi vengono bloccati per impedire il legame con le lectine. Quando vengono applicati i campioni di siero del paziente, le glicoproteine presenti nel campione vengono catturate dagli anticorpi. Successivamente vengono aggiunte proteine leganti i glicani biotinilati per rilevare i glicani, e viene aggiunto streptavidina di-coniugata per etichettare le lectine biotinilate.

Il vetrino per microarray viene quindi scansionato per rilevare la fluorescenza; l'analisi dei dati ottenuti rivela i profili di glicosilazione delle proteine del campione. Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti come l'HPLC. Il metodo consente il rilevamento di singole glicoproteine nel loro stato nativo.

È più rapido e semplice analizzare contemporaneamente le alterazioni della glicosilazione per molteplici proteine. Abbiamo scoperto che i biomarcatori delle malattie, in particolare del cancro e del carcinoma epatico, che abbiamo esaminato con maggiore attenzione, sono spesso glicosilati. Inoltre, abbiamo riscontrato che la capacità di rilevare forme glicosidiche specifiche migliora notevolmente le prestazioni dei biomarcatori in termini di sensibilità e specificità.

Pertanto, questa misura può fornire informazioni sulle alterazioni della glicosilazione di molteplici proteine sieriche nel carcinoma epatocellulare. Può inoltre essere applicata allo studio patologico e alla scoperta di biomarcatori in altri tipi di cancro e malattie, come il cancro del pancreas, il diabete e la malattia di Alzheimer. A dimostrare la procedura sarà Chen Lu, un tecnico del mio laboratorio.

Iniziare questo protocollo preparando innanzitutto il microarray di anticorpi in provette microcentrifuga da 0,8 millilitri su ghiaccio, diluendo tutti gli anticorpi che verranno utilizzati per la stampa del microarray a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro in un minimo di 40 millilitri di PBS; in questo caso, verranno utilizzati 26 anticorpi diversi come controllo positivo. Preparare anche la stessa quantità di BSA biotinilata a 0,5 milligrammi per millilitro in PBS. Utilizzare una pipetta per aliquotare 40 millilitri di ciascun anticorpo nella piastra sorgente da 384 pozzetti posta su ghiaccio.

Quindi, nel software di controllo del microarray, assegnare la posizione di ciascun anticorpo. Successivamente, caricare la piastra sul microarray come sorgente. Poi caricare 20 vetrini per microarray sul microarray come destinazione.

Impostare il microarray per stampare 48 sottoarray identici in cui 27 anticorpi e proteine di controllo vengono depositati in triplice copia secondo uno schema nove per nove. Avviare il microarray per stampare le lamelle del microarray di anticorpi. Raccogliere le lamelle del microarray di anticorpi e conservarle in un contenitore per lamelle con disidratante.

Sigillare la cassetta in un sacchetto di plastica per prevenire la denaturazione delle proteine e l'umidità sui vetrini durante la conservazione. Conservare i vetrini per microarray sigillati a quattro gradi Celsius fino al loro utilizzo. L'aspetto più difficile e importante di questa procedura è il passaggio di bloccaggio chimico.

Per garantire il successo, è fondamentale che venga stampata una quantità sufficiente di anticorpo sull'array microscopico luminoso. Preparare sempre al momento l'IDE di sodio e l'idrocito di acido agarico immediatamente prima dell'esperimento. Inoltre, assicurarsi di eseguire la procedura di ossidazione a quattro gradi, evitando l'esposizione alla luce.

Estrarre le lamelle per microarray dal frigorifero e portarle a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere una lamella dalla scatola di conservazione. Immergere brevemente la lamella in un contenitore con PBS contenente lo 0,1% di tween 20.

Quindi immergere il vetrino in tampone di acetato di sodio 15 millimolare con 0,1% di tween per 10 minuti. Successivamente, preparare una soluzione fresca di periodato di sodio 150 millimolare in tampone di acetato di sodio 15 millimolare e trasferirla in un contenitore per il lavaggio dei vetrini. Conservare in frigorifero, al riparo dalla luce, fino all'uso. Rimuovere il vetrino dal tampone di acetato di sodio e posizionarlo nel contenitore contenente il periodato di sodio fresco con il lato dell'anticorpo rivolto verso l'alto.

Coprire la vaschetta con della pellicola di alluminio per proteggerla dalla luce. Quindi posizionare la vaschetta con i vetrini a quattro gradi Celsius con agitazione delicata per due ore. Rimuovere il vetrino dalla vaschetta e risciacquarlo brevemente tre volte nel buffer di acetato di sodio, per cinque minuti ciascuna.

Incubare il vetrino in 300 millilitri di soluzione bloccante di acido idroglutamico 10 millimolare appena preparata, in una camera di incubazione per due ore a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere i vetrini dalla camera e lavarli con PBS contenente 0,1% di tween per tre minuti. Successivamente, in un contenitore per il lavaggio dei vetrini, incubare il vetrino a microarray in 300 millilitri di soluzione di BSA al 1% in PBS con 0,5% di tween per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Lavare i vetrini in PBS con tween 0,1% tre volte per tre minuti. Posizionare il vetrino su un portavetrini e centrifugare a 1.200 ×g per due minuti per asciugare il vetrino per microarray. Per separare ogni sottoarray, una griglia di cera viene impressa sul vetrino.

Dopo aver preriscaldato l'impronta di cera a 70 gradi Celsius per cinque minuti, inserire il vetrino microarray bloccato nell'impronta di cera con il lato degli anticorpi rivolto verso la cera. Tirare delicatamente la leva per imprimere la cera in modo uniforme sul vetrino. Questo metodo può essere utilizzato per eseguire saggi di profilazione glicidica per un singolo campione o per misurare un singolo epitopo glicidico in più campioni.

Di seguito verranno illustrate prove di profilazione glicidica. Iniziare diluendo 40 microlitri di siero in 360 microlitri di PBS contenente 0,1% di tween, 0,1% di bridge 35 e 100 microgrammi per millilitro, ciascuno, di IgG di topo, ratto, coniglio, capra e asino. Questo volume è sufficiente per applicare sei microlitri di soluzione di siero diluito su ciascuna sotto-matrice.

Applicare con attenzione sei microlitri del campione diluito o del controllo su ciascun sotto-array del vetrino. Incubare il vetrino in una cassetta umidificata con tovaglioli di carta bagnati a temperatura ambiente per un'ora. Lavare il vetrino con PBS contenente 0,1% di tween per tre volte, per tre minuti ciascuna.

Quindi asciugare il vetrino centrifugandolo a 1200 ×g per due minuti. Preparare 20 microlitri di proteine leganti glicani biotinilati a 10 milligrammi per millilitro in PBS tween in un tubo microcentrifuga da 0,8 millilitri su ghiaccio. Applicare sei microlitri dei lectine biotinilati diluiti su ciascun sotto-array del vetrino e incubare nella scatola per vetrini umidificata con tovaglioli di carta bagnati a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver lavato i vetrini con PBS contenente 0,1% di Tween tre volte come in precedenza, asciugare il vetrino centrifugandolo a 1200 ×g per due minuti. Preparare 400 microlitri di neutreven marcato con DITE 5 49 alla concentrazione di 10 milligrammi per millilitro in PBS con 0,1% di Tween in un tubo microcentrifuga da 0,8 millilitri su ghiaccio. Utilizzare una pipetta ripetitiva per applicare sei microlitri di neutreven marcato con DITE 5 49 su ciascun sotto-array e incubare il vetrino nella cassetta umidificata per vetrini a temperatura ambiente per un'ora dopo l'incubazione.

Lavare il vetrino con PBS 0,1% tween tre volte per tre minuti ciascuna. Asciugare il vetrino centrifugandolo a 1200 ×g per due minuti. Scansionare il vetrino utilizzando uno scanner a microarray a fluorescenza con risoluzione di 10 millimetri.

Le impostazioni del laser e del PMT devono essere il più intense possibile, assicurandosi che non si verifichi alcuna saturazione. Aprire l'immagine in Array Pro 3.2. Configurare il modello di array in base alla mappa dell'array che mostra le posizioni dei punti di anticorpo.

Allineare con attenzione ogni cerchio modello sulla posizione corrispondente nell'immagine ed estrarre l'intensità di ogni spot in un file di Excel per ulteriori analisi. Un microarray di anticorpi contenente 48 sottogrid identici con 26 anticorpi contro 20 glicoproteine sieriche e biotina. L'albumina sierica bovina (BSA) è stata progettata e prodotta come descritto in questo video per esaminare l'importanza della procedura di bloccaggio.

Nell'analisi del profilo delle glicoproteine, sono stati generati due microarray identici. Uno non è stato bloccato chimicamente, mentre sull'altro è stato applicato un campione di controllo sulle sotto-matrici nelle colonne uno e tre e un campione di siero HCC pooled è stato applicato sulle sotto-matrici nelle colonne due e 4 22.

Lettine biotinilati specifici per diversi glicani sono stati quindi applicati su ciascun sottoschieramento, come mostrato in queste immagini dei sottoschieramenti. Le lettine si sono legate agli anticorpi di cattura nelle colonne di controllo, generando uno sfondo elevato che non era distinguibile dalle colonne caricate con siero nei microarray non bloccati. Tuttavia, quando lo stesso esperimento è stato eseguito su un vetrino per microarray di anticorpi bloccato chimicamente, non si è verificato alcun legame o un legame molto basso agli anticorpi di cattura nelle colonne di controllo, mentre si è osservato un elevato legame all'antigene nelle colonne caricate con siero.

Questi risultati dimostrano che la procedura di blocco chimico è un passaggio fondamentale per la misurazione dei glicani su glicoproteine catturate da anticorpi. Seguendo il protocollo, è possibile ottenere i profili di glicosilazione di 22 glicoproteine nel siero di HCC una volta acquisita padronanza della tecnica. Questa tecnica può essere eseguita in otto ore se svolta correttamente. Gli anticorpi, quando modificati, possono perdere affinità per i loro antigeni e altre proprietà.

Pertanto, è importante tenerlo presente e utilizzare diversi anticorpi provenienti da fonti differenti seguendo questa procedura. Altre misure, come il rilevamento della concentrazione di ciascuna proteina mediante l'uso della stessa diapositiva a micromatrici, possono essere eseguite per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se l'alterazione della glicosilazione sia dovuta al cambiamento nei livelli di espressione proteica o esclusivamente all'alterazione della glicosilazione su ciascuna proteina individuale. Non dimenticare che lavorare con campioni di siero contenenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti protettivi devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.