Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di "Sicura del fucile" Metodologia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sintetizzare un peptide BSP funzionalizzato utilizzando tecniche a fase solida. Questo viene ottenuto caricando un aminoacido BIS protetto sulla resina di acido idrossietil benzoico. Successivamente, si ripetono cicli di accoppiamento con protezione profonda per attaccare aminoacidi bis funzionalizzati, un processo che allunga il peptide BIS e mostra la funzionalità desiderata.

Infine, il primo acido bis aminoacidico viene modificato con un acido aminoacidico alfa al fine di scindere il peptide BIS dalla resina mediante formazione di di-chetopirazina. I risultati ottenuti mostrano la sintesi riuscita di un peptide BSP funzionalizzato con buona purezza grezza e rese isolate costanti di circa il 10%, in base all'analisi mediante spettrometria di massa con cromatografia liquida. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla sintesi parallela e di librerie di peptide bis, poiché i peptide BIS vengono assemblati su una resina solida, che è più facilmente manipolabile rispetto alle reazioni in soluzione e i sottoprodotti possono essere facilmente rimossi per filtrazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché molti dei passaggi sono difficili da apprendere, in quanto richiedono numerosi dettagli importanti necessari per garantire che tutte le reazioni giungano il più possibile a completamento. Nella sintesi in fase solida, non esiste alcun modo per purificare gli intermedi. Pertanto, per ottenere un prodotto finale puro, ogni reazione deve essere spinta fino al massimo possibile.

Si consiglia di creare un elenco di controllo delle procedure sperimentali per evitare confusione, poiché i passaggi sono di natura ripetitiva. Questo protocollo inizia con il caricamento del primo peptide BSP, la protezione del primo peptide BSP e il cappuccio simultaneo della resina. Per iniziare, caricare il primo peptide BSP pesando 114 milligrammi di resina H-M-B-A-A in un recipiente di reazione da otto millilitri e aggiungendo una barretta magnetica per agitazione.

Chiudere la parte superiore del recipiente con il settimo di gomma ed effluire il tubo con Argon per almeno cinque minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione di aminoacido BIS attivato come descritto nel protocollo scritto. In abbinamento a questo video, trasferire la soluzione nel recipiente di reazione mediante siringa e agitare sotto Argon durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere il settimo e scaricare la miscela di reazione.

Si lava la resina aggiungendo circa due millilitri di clorometano alla resina. Si agita per 30 secondi fino a un minuto, quindi si sgrava. Si ripete questo procedimento quattro volte con DCM e successivamente si lava la resina cinque volte con dimetilformammide.

Per eseguire la protezione profonda del primo bis-amminoacido e contemporaneamente la cappatura della resina, aggiungere lentamente due millilitri di una soluzione di bromuro di idrogeno al 33% in acido acetico e DCM al recipiente di reazione. Lasciare agitare per 15 minuti dopo aver scaricato e lavato la resina cinque volte con DCM. Ripetere la sequenza di protezione D un’ulteriore volta.

Successivamente, lavare la resina cinque volte con DCM seguito da cinque lavaggi con DMF, neutralizzare la resina lavandola due volte con la soluzione al 5% volume/volume di D-I-P-E-A in DMF. Quindi lavare cinque volte con DCM e altre cinque volte con DMF. A questo punto si può procedere al coupling dell'aminoacido bis funzionalizzato protetto.

Per prima cosa, reintrodurre un'atmosfera inerte nel recipiente di reazione contenente la resina, lavandolo tre volte con DCM anidro. Quindi, fissare un settino e sottoporre il recipiente a un purgaggio con linea di argon e lavaggio aggiungendo da uno a due millilitri di DCM anidro e agitando per 30 secondi. Successivamente, svuotare il recipiente fino a quando il borbottio della linea di argon non inizia a salire.

Ripetere questo processo almeno un’altra volta. Successivamente, preparare una soluzione di acido bis amino funzionalizzato in un tubo a saggio asciutto alla fiamma sotto atmosfera di Argon. Aggiungere 47 microlitri di DIC e agitare per 90 minuti.

Quindi aggiungere 35 microlitri di D-I-P-E-A in 666 microlitri e DMF anidro alla resina e agitare per ulteriori cinque minuti. Trasferire la soluzione del BIS aminoacido preattivato nel recipiente mediante siringa e agitare tutta la notte e il giorno seguente. Svuotare la miscela di reazione e lavare due volte con DCM anidro sotto argon.

Un passaggio fondamentale di questo procedimento è il legame degli amminoacidi biz. Per garantire la chiusura degli anelli di di-cheto piperazina, si impiegano tempi di reazione più lunghi con agenti attivanti aggiuntivi. Per favorire la chiusura della di-cheto pirazina, aggiungere una soluzione di HOAT e DIC e agitare sotto argon per un'ora.

Successivamente, rimuovere il setto e scaricare la miscela di reazione. Lavare la resina cinque volte con DCM e cinque volte con DMF. Questa sezione descrive la protezione totale dell'aminoacido BIS funzionalizzato, la protezione totale di F moc e l'acilazione del primo aminoacido BIS.

Per eseguire la deprotezione profonda dell'amminoacido bifunzionalizzato protetto, aggiungere lentamente due millilitri di una soluzione di TFA e TIPS al recipiente di reazione e agitare per un'ora dopo lo scarico; lavare la resina con DCM per circa 30 secondi, quindi scaricare e ripetere il lavaggio con DCM per cinque volte. Ripetere quindi l'intera sequenza di lavaggio della resina per deprotezione profonda seguendo il ciclo di lavaggio A-D-C-M-D-M-F. Neutralizzare la resina lavandola due volte con una soluzione al 5% volume/volume di D-I-P-E-A in DMF.

Eseguire quindi un altro lavaggio D-C-M-D-M-F. A partire da questo punto, il peptide BIS può essere allungato con altri aminoacidi bis funzionalizzati o funzionalizzato sull'acido carbossilico del gruppo azotato terminale, oppure entrambe le operazioni. Per rimuovere il gruppo protettivo FM, aggiungere una soluzione di due millilitri di piperidina al 20% in DMF e mescolare la reazione per 20 minuti.

Svuotare e lavare la resina cinque volte con DMF. Ripetere questo processo una volta in più dopo un'ulteriore lavaggio della resina. Isolare il primo bis-amminoacido aggiungendo la soluzione di amminoacido preparata al recipiente di reazione e agitare per sei ore come passaggio finale.

Lavare la resina cinque volte con DCM e cinque volte con DMF. L'ultima parte di questo protocollo prevede la rimozione del gruppo Bach dall'amminoacido legato alla resina e il distacco dalla resina stessa. Aggiungere innanzitutto due millilitri di una soluzione T-F-A-D-C-M uno a uno al recipiente di reazione e agitare per 30 minuti.

Svuotare e lavare la resina cinque volte con DCM. Quindi ripetere questo processo una volta ancora. Lavare e svuotare la resina per 30 secondi, cinque volte con DCM e cinque volte con DMF.

Successivamente, aggiungere due millilitri di una soluzione di 10%D-I-P-E-A in DMF anidro e agitare da 24 a 48 ore. Infine, raccogliere la miscela di reazione in un pallone a fondo rotondo pre-pesato. Trasferire 30 microlitri di questa soluzione in 450 microlitri di Tetra Hydro FU in un file lc MS e inviarla per analisi.

Lavare la resina con ulteriori aliquote di DMF e raccogliere nel pallone a fondo tondo. I seguenti metodi possono essere utilizzati per monitorare le trasformazioni chimiche sulla resina durante la sintesi. Per rilevare i gruppi ossidrilici liberi, eseguire il test con il rosso di metile rimuovendo innanzitutto circa un milligrammo di resina secca mediante pipetta monouso.

Sciacquare in un recipiente di reazione da quattro millilitri. Aggiungere una soluzione di rosso metile preparata come descritto nel testo e agitare per cinque-dieci minuti. Svuotare e lavare la resina cinque volte con DCM; la presenza di perle di resina arancioni o rosse indica la presenza di gruppi ossidrilici liberi.

Questo test può essere utilizzato per valutare il caricamento del primo aminoacido bis e i passaggi di cappucciatura della resina. Per rilevare le ammine secondarie, eseguire il test del cloralio trasferendo circa un milligrammo di resina secca in una piccola provetta mediante pipetta monouso. Aggiungere tre gocce sia della soluzione di cloralio 0,8 millimolare in DMF sia della soluzione di aldeide acida al 2% in DMF.

E lasciamo in posa a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti. In questo caso, la presenza di sfere di resina di colore blu o viola indica che sono presenti ammine secondarie libere sul composto legato alla resina. Per confermare l'efficienza di attivazione, eseguire il test di intrappolamento dell'attivazione: il composto attivato durante la sintesi può essere valutato trasferendo da cinque a dieci microlitri della soluzione attivata in un vial per cromatografia liquida-spettrometria di massa contenente 50 microlitri di olaine, miscelato manualmente.

Per alcuni secondi, la soluzione dovrebbe diventare gialla, quindi diluire con 450 microlitri di tetrahydrofuran e sottoporre ad analisi LC-MS. Il prodotto finale e gli intermedi attivati possono essere valutati utilizzando un sistema LCM S dotato di una colonna in fase inversa C 18 e un sistema di solventi costituito da acqua e acetonitrile con acido formico al 0,1%. Questo tracciato L-C-M-S-U-V fornisce un esempio della buona purezza del prodotto grezzo.

Il picco principale nello spettro riscontrato a 21,3 minuti presenta una massa compatibile con la massa prevista del prodotto. Questo può essere visualizzato nello spettro di massa del prodotto grezzo, in cui il picco rivela i principali picchi corrispondenti alla massa, alla massa più quella dello ione sodio, nonché alla massa meno quella del gruppo protettivo IV DDE. Qui viene mostrato il tracciato UV-LCMS degli spettri purificati che rivela un prodotto molto puro a 21,3 minuti e lo spettro di massa che conferma l'identità di questo picco trier purificato.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare le tecniche di sintesi solid fase per ottenere peptidi bis funzionalizzati dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei peptidi biz per esplorare applicazioni nelle interazioni proteina-proteina e nella catalisi. Una volta padroneggiata, tale tecnica può portare alla sintesi di un trimero di peptidi biz funzionalizzato in quattro o cinque giorni, se eseguita correttamente.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere le perle immerse nella reazione e nelle soluzioni di lavaggio seguendo questo protocollo. Altri metodi, come la sintesi in parallelo o quella di librerie, possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, ad esempio sull'effetto della stereochimica o di funzionalità alternative sul legame proteico o sull'attività catalitica. Non dimenticare che lavorare con reagenti organici può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di idonei dispositivi di protezione personale e di una cappa aspirante, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.