Misurazione della pressione ventricolare sinistra nel tardo Mice embrionali e neonatale

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la pressione del ventricolo sinistro o pressione VS in topi embrionali tardivi e neonati. Innanzitutto, si prepara l'attrezzatura. Un ago collegato a un trasduttore di pressione deve essere allineato con una sonda ecografica.

Quindi si prepara un topo e il suo ventricolo sinistro (LV) viene visualizzato mediante ultrasuoni. Successivamente l'ago viene avanzato nella cavità del ventricolo sinistro e vengono registrate misurazioni della pressione pulsatile. Infine, i risultati mostrano le pressioni sistoliche nei topi embrionali tardivi e nei neonati precoci mediante questa cateterizzazione guidata da ultrasuoni con catetere riempito di liquido.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il catetere servo, senza misurazioni di pressione o a stato solido, è che la pressione può essere misurata in modo robusto e ripetibile nei topi embrionali e neonatali in fase avanzata. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, poiché è complesso mantenere l'orientamento dell'embrione all'interno della sacca embrionale, dato che l'embrione tende a ruotare. Applicando la sonda ecografica, a seconda dello stadio del topo da studiare, selezionare e riempire una sonda con acqua distillata.

Posizionare la sonda sul supporto regolabile del sistema ecografico. Regolare il supporto in modo da ottenere una vista longitudinale del ventricolo sinistro (LV) di un topo montato sulla piattaforma, con l'apice del LV orientato verso il braccio di iniezione. Il sistema di pressione è costituito da un trasduttore di pressione riempito di liquido, da un amplificatore a ponte e da un sistema di acquisizione dati con grafico di laboratorio.

Per svuotare il tubo, si utilizza un pacchetto software e una siringa da 20 millilitri riempita con soluzione salina eparinizzata al 10%. Assicurarsi che non rimangano bolle d'aria intrappolate nel tubo o sopra il trasduttore. Il collegamento del tubo al trasduttore avviene mediante rubinetti a tre vie, connettori a baionetta e raccordi per tubi flessibili.

Calibrare il sistema del trasduttore di pressione con un manometro montando il tubo dell'ago e la guaina nel braccio di iniezione. Sostituire il manometro con una guaina per fissare il tubo al braccio di iniezione. La guaina è semplicemente un corpo di siringa modificato da tre millilitri.

Stringere il trasduttore di pressione in un anello. Posizionarsi all'altezza approssimativa della piattaforma di imaging per evitare ostruzioni. Applicare l'ago della dimensione più grande possibile al tubo dell'ago e iniettare ulteriore soluzione salina eparinizzata fino a quando non escono alcune gocce.

Estrai nuovamente l'ago. Assicurati che non siano rimaste bolle intrappolate nel tubo o sopra il trasduttore. Ora, posiziona un mucchio di gel ecografico sulla piattaforma di imaging.

Ruotare l'ago dal corpo della siringa da tre millilitri in modo che il bordo smussato dell'ago sia rivolto verso l'alto. Quindi, utilizzando il supporto regolabile, allineare con attenzione la sonda in modo che l'ago possa essere inserito direttamente nel gel. Al centro della sonda di imaging, l'ago deve trovarsi sufficientemente al di sotto della sonda da non perforare il rivestimento della sonda, ma abbastanza vicino da rientrare nel campo focale della sonda.

Se necessario, l'ago può essere piegato manualmente in modo da rimanere nel piano corretto durante tutto il suo percorso. Mantenendo l'allineamento, ritrarre l'ago e sollevare la sonda di imaging per posizionare un topo sulla piattaforma di imaging. Sostituire l'ago prima di procedere con l'anestesia del topo.

Una madre gravida o un topo neonato possono essere sottoposti a inalazione continua di 1,5% di isoflurano mediante un tubicino inserito in un cono nasale standard, adatto alla piccola testa di un topo neonato precoce. Per i topi neonati, fissare l'animale sulla piattaforma di imaging del sistema ecografico in posizione supina, con l'apice del ventricolo sinistro rivolto verso il braccio dell'iniezione. Per i topi neonati, mantenere la temperatura corporea con una lampada riscaldante esterna.

I topi gravidi richiedono una preparazione più accurata. Applicare del gel ecografico alle estremità per garantire un accoppiamento con il rilevatore di ECG collegato e monitorare la frequenza cardiaca. Inserire il termometro rettale per il feedback.

Controllo della temperatura corporea. Rimuovere i peli dall'addome con una crema depilatoria e risciacquare con acqua. Aprire l'addome utilizzando forbici da dissezione e pinze curve.

Esternare un corno uterino e posizionarlo su un pad di garza inumidito con soluzione salina calda. Durante tutta la procedura, mantenere umidi tutti gli embrioni e l'addome della madre. Con aggiunte periodiche di soluzione salina calda, manipolare con attenzione un embrione nella posizione corretta per ottenere una vista para-sternale lungo l'asse del VS. Utilizzando la sonda ecografica, si può usare un rotolo di garza per aiutare a mantenere l'orientamento dell'embrione.

Procedere misurando la pressione in tutti gli embrioni di un corno uterino prima di ripetere il processo sull'altro corno uterino. Iniziare applicando del gel ecografico Degas preriscaldato su un topo embrionale o neonatale. Abbassare la sonda di imaging e regolare l'angolazione della piattaforma di imaging per ottenere una vista ottimale dell'asse lungo del ventricolo sinistro in proiezione parasagittale.

Non regolare l'angolo della sonda perché si perderebbe l'allineamento dell'ago. Mentre si monitora l'immagine del VS sullo schermo dell'ecografo, avanzare lentamente l'ago fino a quando non si trova vicino alla base della sonda. Regolare la posizione dell'ago e della sonda, se necessario, per correggere eventuali spostamenti di allineamento.

L'immagine del topo neonato mostra un'orientazione ideale per il ventricolo sinistro, difficile da ottenere con un embrione. Iniziare la registrazione dei dati di pressione. Lavare delicatamente l'ago con soluzione salina e chiudere il rubinetto a tre vie rispetto alla siringa da 20 millilitri e rispetto all'atmosfera.

Osservare la pressione. Aumentare nel programma per assicurare che venga applicata una pressione minima all'ago. Avanzare lentamente l'ago finché non è visibile al bordo dell'immagine ecografica, ma non ancora nel ventricolo sinistro.

Se necessario, regolare la posizione dell'ago per entrare nel VS all'apice. Regolare la posizione della sonda, se necessario, per mantenere un'immagine chiara dell'ago. Avanzare l'ago nel lume del VS mentre si registrano i dati di pressione e si monitora la posizione dell'ago sull'immagine ecografica.

L'inizio delle registrazioni pulsanti dal trasduttore di pressione conferma la posizione all'interno del lume del ventricolo sinistro (LV). Se l'ago sembra trovarsi nel lume del LV, ma le registrazioni di pressione non sono pulsanti, lavare l'ago con un leggero tocco sullo stantuffo della siringa fino a quando non si rileva un aumento della pressione. Il lavaggio con fluido deve essere minimo per evitare di alterare il comportamento del cuore durante le misurazioni della pressione.

Se le letture della pressione non sono ancora pulsanti, l'ago potrebbe trovarsi al di sopra o al di sotto del piano corretto e non essere inserito nel lume del ventricolo sinistro. Ritirare l'ago, sciacquarlo con soluzione salina ed avanzarlo nuovamente.

Se non si ottengono ancora letture pulsanti, passare al topo successivo e utilizzare sempre un ago nuovo per ogni topo. L'intera procedura deve essere eseguita nel modo più rapido possibile per minimizzare lo stress subito dagli embrioni e dai neonati durante l'esperimento. La pressione ventricolare di topi C 57 Black six J è stata misurata in un topo E 18.

Come previsto, la pressione era vicina a zero quando l'ago si trovava all'esterno del VS e mostrava una lettura pulsatile quando era all'interno del VS in un topo P14 più anziano. La lettura della pressione era smorzata perché l'ampiezza della pressione era maggiore e la frequenza cardiaca era più elevata. Le frequenze cardiache sono state determinate a partire dalla frequenza delle letture di pressione pulsatile per diverse età comprese tra E18 e P14.

Le frequenze cardiache sono state misurate e le pressioni sistoliche del ventricolo sinistro sono state calcolate. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di inumidire periodicamente gli embrioni e verificare lo stato della madre. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori in fisiologia cardiovascolare per esplorare le variazioni della pressione sanguigna nei topi in via di sviluppo.