Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria
18 marzo 2012
Si descrivono l'uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni di Aspergillus fumigatus Sideroforo A (Sida), un flavina-dipendente monoossigenasi. Abbiamo poi mostrano gli spettri corrispondenti alle specie di cui la reazione di Sida e calcolare le costanti di velocità per la loro formazione.
Questa procedura utilizza uno strumento a flusso arrestato per rilevare le diverse forme spettrali della SID A e misurare le velocità. La reazione catalizzata dalla SID A può essere suddivisa in semireazioni riduttive e ossidative del FAD. Il flavina ossidato si lega al N-A-D-P-H e reagisce formando il flavina ridotto e NADP più; la reazione con l'ossigeno molecolare e il legame dell'ornitina portano alla formazione del C quattro.
Un flavina idrossilata dopo l'idrossilazione dell'ornitina, la flavina idrossilata si disidrata per formare l'enzima ossidato. NA DP+ rimane legato per tutto il ciclo catalitico ed è l'ultimo substrato ad essere rilasciato. Lo strumento a flusso arrestato consente una rapida miscelazione di piccoli volumi di reagenti e la registrazione.
Le variazioni spettrali nel tempo consentono di misurare, mediante spettrofotometria, la velocità di formazione e di scomparsa di intermedi transitori in una reazione catalizzata da enzimi. Due membri del mio laboratorio, Rita Robinson ed Enviro Romero, dimostreranno questi esperimenti utilizzando il sistema modello della flavina monoossigenasi. Versare 250 millilitri di tampone fosfato di potassio 100 millimolare in un matraccio di Büchner da 500 millilitri contenente una barretta magnetica.
Sigillare il matraccio con un tappo di gomma, quindi posizionarlo su una piastra magnetica e collegare il tubo corto del matraccio a una linea di vuoto. Degasare il tampone sotto vuoto per un'ora a temperatura ambiente con agitazione, seguito da un risciacquo con argon. Ripetere cinque volte.
Infine, risciacquare il pallone con Argon per 10 secondi. Scollegare il pallone dalla linea vuoto e posizionarlo all'interno della camera a gas inerte. Continuare a mescolare energeticamente lasciando il pallone aperto.
Riempire le siringhe del serbatoio con soluzioni di glucosio ossidasi a 18,13 unità per millilitro e di glucosio a 100 millimoli per litro. Impostare ora le valvole di avanzamento sulla posizione di caricamento. Riempire le siringhe di avanzamento.
Successivamente, ruotare la valvola F in posizione di avanzamento. Utilizzando il software di controllo Pro Data, fare clic su "svuota la siringa di arresto", quindi spingere il tampone dalla siringa di avanzamento F attraverso il circuito di flusso aumentando manualmente il relativo pistone di avanzamento. Proseguire con le altre tre siringhe di avanzamento, equilibrando per un'ora.
Ora ricaricare le siringhe del serbatoio e ripetere il lavaggio del sistema a flusso arrestato. Per preparare il tampone saturato di ossigeno, far gorgogliare la soluzione con ossigeno al 100% per un'ora con agitazione.
Quindi rimuovere l'ago corto dalla fiala e attendere 10 secondi. Procedere rimuovendo l'ago lungo e posizionare la fiala chiusa nella cappa a flusso laminare. Per la soluzione di N-A-D-P-H.
Posizionare un tubo einor da 1,5 millilitro contenente un milligrammo di N-A-D-P-H all'interno della camera a guanti. Sciogliere in 300 microlitri di tampone fosfato di potassio 100 millimolare anaerobico, pH 7,5.
Rimuovere 30 microlitri per determinare la concentrazione di N-A-D-P-H. Per rimuovere l'ossigeno dalla soluzione enzimatica, trasferire la soluzione in un vial da 25 millilitri contenente un’asta magnetica, un tappo con setto in gomma e un sigillo in alluminio. Posizionare sul ghiaccio.
Collegarsi a una linea a vuoto, quindi sottoporre a degasaggio mediante vuoto per 20 minuti, seguito da un risciacquo con argon. Infine, risciacquare il vial con argon per 10 secondi e scollegarlo dalla linea di vuoto. Posizionare il vial sul ghiaccio all'interno della camera a guanti.
Nella finestra del pannello di controllo del software di controllo pro data, selezionare l'array di fotodiodi, il trigger esterno e la scala logaritmica. Avviare inoltre il software pro data viewer e definire la directory per l'archiviazione dei file di dati.
Ora sostituire la soluzione nelle siringhe del serbatoio C e F con tampone fosfato di potassio 100 millimolare anaerobico a pH 7,5. Ruotare le valvole C e F sulla posizione di avanzamento. Fare clic su "svuota la siringa di arresto" nel software di controllo Pro Data.
Quindi spingere il tampone da entrambe le siringhe di avanzamento attraverso il circuito di flusso manualmente innalzando il relativo pistone di avanzamento. Ripetere il risciacquo con le siringhe del serbatoio C e F altre tre volte. Per assicurare la rimozione completa della glucosio ossidasi dal circuito di flusso, procedere facendo clic su baseline nel software di controllo dei dati pro.
Sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio F con la soluzione enzimatica. Ruotare la valvola F in posizione di avanzamento. Fare clic su "svuota la siringa di arresto" nel software di controllo Pro Data.
Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa motrice F attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il relativo pistone motore. Tornare al software di controllo pro data e impostare il tempo di acquisizione a 60 secondi. Verificare che entrambe le siringhe motrici siano riempite con le rispettive soluzioni e che i pistoni motori siano a contatto con i pistoni delle siringhe motrici.
Posizionare entrambe le valvole sulla posizione di azionamento e fare clic su acquisisci nel software di controllo Pro Data per eseguire l'azionamento. Acquisire i dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplice replicato utilizzando il valore di A 4 52 nanometri ottenuto dagli azionamenti. Determinare la concentrazione dell'enzima prima del mescolamento e preparare quattro millilitri di soluzione di N-A-D-P-H.
Con una concentrazione 1,5 volte superiore, riempire la siringa del serbatoio C con la soluzione di N-A-D-P-H e svuotare e riempire nuovamente la siringa di arresto per tre volte, come mostrato in precedenza. Ora, acquisire gli spettri durante la riduzione dell'enzima, lavando il contenuto dal circuito di flusso con tampone fosfato di potassio anaerobico 100 millimolare a pH 7,5. Ora fare clic su baseline nel software di controllo dati pro.
Quindi mescolare 200 microlitri di soluzione madre dell'enzima con 1000 microlitri di tampone fosfato di potassio anaerobico 100 millimolare, pH 7,5. Sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio A con la soluzione enzimatica.
Portare la valvola A sulla posizione di avanzamento nel software di controllo Pro Data. Cliccare su siringa arresto vuota. Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa di avanzamento A attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il relativo pistone di avanzamento.
Impostare il tempo di ritardo a 0,5 secondi e il tempo di acquisizione a 60 secondi. Verificare che tutte le siringhe di alimentazione siano piene delle rispettive soluzioni e che i pistoni di alimentazione siano a contatto con i pistoni delle siringhe di alimentazione. Successivamente, posizionare tutte le valvole di alimentazione sulla posizione di alimentazione e fare clic su acquisisci nel software di controllo pro data.
Ottenere i dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplice replicato. Successivamente, sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio B con una soluzione di N-A-D-P-H, 1,5 volte più concentrata rispetto alla soluzione enzimatica nella siringa A. Ruotare la valvola B in posizione di avanzamento e svuotare e riempire nuovamente la siringa di arresto per tre volte, come mostrato in precedenza nella finestra del pannello di controllo.
Impostare il tempo di ritardo a 0,5 secondi. Dopo un'acquisizione di 20 secondi, sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio con il tampone ossigenato. Ruotare la valvola C in posizione di avanzamento.
Effettuare tre risciacqui nel software di controllo pro data. Impostare il tempo di ritardo a 15 secondi e il tempo di acquisizione a 900 secondi. Continuare ad acquisire gli spettri durante la ri-ossidazione dell'enzima completamente ridotto nello strumento a flusso arrestato.
La riduzione anaerobica di SID A con N-A-D-P-H può essere monitorata misurando i cambiamenti nello stato redox della flavina utilizzando l'assorbanza a 452 nm. I cambiamenti spettrali vengono registrati nel tempo, dall'SID A ossidato allo spettro finale di SID A completamente ridotto. La velocità di questo passo enzimatico può essere determinata adattando i dati all'equazione appropriata. La velocità di ossidazione e gli intermedi della reazione possono essere inoltre determinate utilizzando la modalità di doppia miscelazione del flusso arrestato in questa reazione mediante AF Sid A. L'intermedio idrossi flavinico C quattro A è chiaramente rilevato con un lambda max di 380 nanometri, mentre l'enzima ossidato presenta un lambda max di 450 nanometri.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro-sei ore se eseguita correttamente. Ricordarsi di garantire che le soluzioni siano anaerobiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indagare sia l'ione relativo che quello ulcerativo di FLA in ulteriori esperimenti a valle, come la chimica rapida.
Quentin può contribuire a chiarire la triste natura degli intermedi.
Panoramica
Questo studio utilizza uno strumento a flusso arrestato per analizzare le semireazioni riduttive e ossidative della sideroforo A (SidA) di Aspergillus fumigatus, una monooxygenasi dipendente dal flavina. La ricerca comprende l'analisi spettrale degli intermedi di reazione e il calcolo delle costanti di velocità per la loro formazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica biochimica
- Enzimologia
- Spettroscopia
Sfondo
- Aspergillus fumigatus è un patogeno fungino significativo.
- La sideroforo A (SidA) svolge un ruolo cruciale nell'acquisizione del ferro.
- Le monoidrossilasi dipendenti dal flavina sono importanti per varie reazioni biochimiche.
- Comprendere i meccanismi di reazione può contribuire allo sviluppo di strategie antifungine.
Scopo dello studio
- Studiare i meccanismi di reazione della SidA.
- Misurare le costanti cinetiche degli intermedi di reazione.
- Fornire informazioni sul ciclo catalitico degli enzimi dipendenti dalla flavina.
Metodi Utilizzati
- Spettroscopia stopped-flow per la rapida miscelazione e analisi spettrale.
- Preparazione di condizioni anaerobiche per le reazioni enzimatiche.
- Misurazione delle variazioni spettrali nel tempo per determinare la cinetica della reazione.
- Utilizzo di tamponi e reagenti specifici per facilitare le reazioni.
Risultati principali
- Identificazione di diverse forme spettrali di SidA durante le reazioni.
- Calcolo delle costanti di velocità per la formazione degli intermedi di reazione.
- Dimostrazione del ciclo catalitico che coinvolge NADP e ossigeno.
- Caratterizzazione degli intermedi transitori nel percorso di reazione.
Conclusioni
- La tecnica del flusso interrotto è efficace per lo studio della cinetica enzimatica.
- Le informazioni ottenute possono orientare future ricerche sugli enzimi dipendenti da flavina.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del metabolismo fungino.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La spettrofotometria con flusso interrotto permette un'analisi cinetica precisa delle reazioni delle monoidrossilasi dipendenti da flavina, supportando la riduzione del rischio meccanicistico e la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta. Risolvendo le semireazioni riduttive e ossidative e quantificando gli intermedi transitori, questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva per i portafogli mirati agli enzimi. L'adattabilità del metodo ad altri sistemi dipendenti da flavina lo colloca come una capacità riutilizzabile nei flussi di R&S della biotecnologia farmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente la misurazione diretta delle costanti di velocità intrinseche per la verifica di ipotesi meccanicistiche.
- Permette l'identificazione e la caratterizzazione di intermedi catalitici per la validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Facilita la riduzione dei rischi biologici chiarificando i percorsi di reazione enzimatica.
- Migliora l'affidabilità predittiva per lo sviluppo di bersagli enzimatici nei portafogli di scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture spettrali validate per la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi.
- Consente il monitoraggio quantitativo degli stati redox degli enzimi per una valutazione affidabile dei composti.
- Permette la preparazione di sistemi biologici robusti per flussi di lavoro di screening successivi.
- Consente il riutilizzo della piattaforma su diversi bersagli di monoidrossigenasi dipendenti da flavina.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le informazioni meccanicistiche ai sistemi enzimatici rilevanti per la malattia, quando applicabile.
- Garantisce una continuità dalla validazione cinetica nella fase di scoperta alla selezione dei modelli preclinici.
- Guida le decisioni di avanzamento con rischio calibrato chiarificando i meccanismi catalitici.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali attraverso il rilevamento quantitativo di intermedi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra all'interfaccia tra la fase iniziale di scoperta e l'identificazione del composto promettente, fornendo chiarezza meccanicistica prima dell'avanzamento preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi risolvendo le semireazioni riduttive e ossidative.
- Screening: Fornisce output spettrali riproducibili e quantitativi per la prontezza del saggio.
- Analisi: Permette la misurazione delle costanti di velocità e il rilevamento di intermedi transitori per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici alla selezione di modelli preclinici quando i bersagli enzimatici sono rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato adattabile ad altre monoidrossilasi dipendenti da flavina.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli enzimi come target.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni cinetiche standardizzate, riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Consente decisioni informate di tipo go/no-go e una selezione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di asset mirati agli enzimi, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in enzimologia e analisi dei dati cinetici.
- Necessita dell'accesso a spettrofotometria a flusso arrestato e infrastrutture per la manipolazione in condizioni anaerobiche.
- Richiede una rigorosa standardizzazione interdisciplinare nella preparazione dei tamponi e nella calibrazione degli strumenti.
- Adattabile a diversi sistemi di monoidrossilasi dipendenti da flavina, previa ottimizzazione adeguata.
- Dipende dal mantenimento di condizioni strettamente anaerobiche per una misurazione accurata delle semireazioni.
