Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

L'obiettivo generale di questa procedura è differenziare cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Coltivare innanzitutto cellule staminali embrionali di topo su fibroblasti embrionali di topo primari, aggiungendo fattore inibitore della leucemia. Successivamente, potenziare il processo di normalizzazione aggiungendo noggin, FGF B e FGF otto; indurre la specificazione dei neuroni motori mediante incubazione con acido retinoico e agonista di smoothened, seguita da allungamento dell'assone e maturazione dei neuroni motori.

Infine, utilizzare la microscopia a immunofluorescenza per esaminare le cellule MES differenziate che esprimono una forte fluorescenza GFP. La generazione di elevate quantità di neuroni motori ha facilitato la ricerca sulle malattie dei motoneuroni rispetto ai protocolli attualmente esistenti. Questo approccio per differenziare le cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori è più efficiente. Questo metodo può fornire informazioni utili sulla atrofia muscolare spinale.

Si può applicare anche ad altre malattie dei motoneuroni, come la sclerosi laterale amiotrofica. Per seminare i fibroblasti primari di topo embrionale, ricoprire quattro piastre da coltura tessutale da 100 millimetri con otto millilitri di soluzione di gelatina allo 0,1%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, eliminare il liquido in eccesso. Diluire ora una fiala di mitomicina C nel PMEF attivato in 40 millilitri di mezzo PMEF, distribuire sulle quattro piastre e coltivare per un massimo di una settimana.

Successivamente, scongelare un flacone di cellule MES in un bagno a 37 gradi. Lavare le cellule con cinque millilitri di mezzo E ES in un tubo da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione a 800 giri al minuto per cinque minuti.

Aspirare il soprannatante e risospendere le cellule MES in 20 millilitri di mezzo ES con fattore inibitore della leucemia appena aggiunto. Procedere rimuovendo 10 millilitri di mezzo dalle colture PMEF e sostituendoli con 10 millilitri della sospensione di cellule ES HBG tre. Monitorare l'evoluzione delle cellule MES nel tempo, da piccole colonie a 24 ore fino a colonie di circa 100 micrometri di diametro a 72 ore dopo la semina.

Sostituire il mezzo ogni giorno per mantenere la proliferazione delle cellule per l'induzione delle cellule MES. Differenziamento in neuroni motori. Le cellule staminali embrionali del topo devono prima essere separate dalle cellule feeder PMEF e successivamente coltivate in un ambiente di sospensione nel giorno dell'induzione.

Per ogni coltura ES da 100 millimetri, preparare un fiasco T150 rivestito con gelatina allo 0,1%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere l'eccesso di gelatina e lavare tre volte con PBS. Procedere quindi aspirando con attenzione il mezzo di coltura dalla coltura ES, avendo cura di non staccare le colonie debolmente aderenti. Lavare poi una volta con 10 millilitri di PBS.

Ora, per separare le cellule MES dai PMEF, aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA 0,25% e incubare per tre-cinque minuti. A 37 gradi Celsius, verificare che le cellule staminali e i PMEF si siano staccati dalla piastra. Quindi aggiungere 15 millilitri di mezzo ES fresco e disperdere le colonie mediante pipettatura.

Trasferire la sospensione cellulare nel flacone T150 preparato e rivestito con gelatina, quindi incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius affinché le PFS si attacchino alla superficie gelatinizzata. A questo punto raccogliere le cellule MES in sospensione in un tubo da 50 millilitri e formare il pellet mediante centrifugazione. Risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo di differenziamento neurale.

Contare il mezzo utilizzando un emocitometro, quindi seminare su una piastra da coltura in sospensione da 100 millimetri per l'indifferenziazione. Al primo giorno, verificare al microscopio che le cellule MES abbiano formato piccoli aggregati sospesi chiamati corpi embrionali. Poiché vi potrebbero essere residui di PMEF aderenti alla piastra, trasferire le cellule staminali embrionali in sospensione e il mezzo in un tubo da 15 millilitri, quindi centrifugare a 500 giri al minuto per tre minuti.

Per raccogliere i corpi embrionali, aspirare attentamente il mezzo e aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco di differenziamento neurale ai corpi embrionali pellettizzati, quindi seminare le cellule in una nuova piastra batteriologica per 24 ore di differenziamento. Al secondo giorno, agitare delicatamente la piastra e trasferire il mezzo e i corpi embrionali in un tubo da 15 millilitri. Lasciare sedimentare i corpi embrionali per gravità, quindi aspirare con cura il mezzo, risospendere i corpi embrionali in 10 millilitri di mezzo di differenziamento per neuroni motori.

Coltivare il mezzo EBS in una nuova piastra batterica per cinque giorni in condizioni di differenziamento. Al giorno sette, verificare che gli EBS abbiano un diametro di circa 150-200 micrometri ed esprimano forti segnali GFP in differenziamento. Al giorno cinque, due giorni prima della dissociazione degli EBS, posizionare coprivetrini rotondi da 12 millimetri sul fondo di una piastra a 24 pozzetti.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di poli DL-ornitina a 100 microgrammi per millilitro e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Aspirare la poli DL-ornitina e far asciugare all'aria le piastre e i coverslip in una cappa a flusso laminare. Sciacquare i pozzetti della piastra con acqua bidistillata per tre volte.

Lasciare asciugare all'aria per rivestire i coprioggetti. Preparare una nuova diluizione di due microgrammi per millilitro di laminina murina in cinque millilitri di PBS 1X freddo. Aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto e incubare a quattro gradi Celsius per tutta la notte.

Lavare due volte con PBS durante la differenziazione. Al settimo giorno, raccogliere gli EBS in un tubo da 15 millilitri e lasciare sedimentare gli EBS per gravità. Dopo quattro lavaggi con PBS, aggiungere un millilitro di ACU max agli EBS, mescolare delicatamente e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare l'eccesso di ACU max che ricopre gli EBS.

Ora aggiungere tre millilitri di mezzo MND e dissociare gli EBS mediante pipettaggio per circa 20 volte utilizzando una pipetta micro una millilitro einor, quindi incubare per due minuti a temperatura ambiente e far passare la sospensione cellulare attraverso un tappo filtrante in un tubo da 12 per 75 millimetri. Ripetere il passaggio di dissociazione con gli aggregati e le cellule rimanenti trattenuti dal filtro, al fine di arricchire il rendimento di cellule singole in una sospensione finale di cellule singole di sei millilitri. Mescolare delicatamente la sospensione di cellule singole e contare le cellule utilizzando un emocitometro; diluire le cellule nel mezzo MND completo fino a una densità di due per 10 alla quinta cellule per millilitro piastra.

0,5 millilitri di sospensione cellulare per pozzetto delle piastre da 24 pozzetti preparate, contenenti coprioggetti rivestiti con poli-DL-ornitina e laminina. Le cellule differenziate estendono lunghi neuriti dopo due giorni. In coltura, HBG tre è una linea di cellule staminali embrionali derivata da un topo transgenico che esprime EGFP sotto il controllo di un promotore specifico per i motoneuroni, HB nine, mediante un protocollo di differenziazione definito.

Le cellule MES possono essere utilizzate per ottenere neuroni motori. Le cellule MES indifferenziate formano colonie rotonde sulla superficie di uno strato di cellule fibroblastiche di supporto. Presentano una debole espressione di GFP.

Queste cellule MES sono state separate dai livelli di cellule supporto e coltivate su piastre a bassa adesione per formare corpi embrionali. Le cellule MES differenziate hanno espresso una forte fluorescenza GFP dopo il settimo giorno. I corpi embrionali differenziati sono stati dissociati e seminati su piastre rivestite con poli-DL-ornitina e laminina.

Dopo due giorni di coltura, le cellule differenziate estendono lunghi neuriti dai corpi cellulari delle cellule seminate; i neuroni motori derivati da cellule MES possono essere caratterizzati mediante colorazione immunoistochimica a fluorescenza. Queste cellule positive per GFP esprimono il marcatore neuronale pan-specifico neurofilamento e i due marcatori specifici per neuroni motori. Eyelid one e la colinacetiltransferasi, mentre le colorazioni DPI evidenziano i nuclei, considerati nel complesso.

Il nostro protocollo di differenziazione in due passaggi fornisce un metodo efficiente per differenziare le cellule MES in neuroni motori spinali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione di come differenziare in modo efficiente le cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. In conclusione, ricordate che l'elevata qualità delle cellule staminali embrionali di topo è il parametro più critico per generare in modo efficiente neuroni motori.