La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia
23 luglio 2008
Questo video mostra come condurre differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali di topo di corpi embrionali usando il metodo goccia pendente.
Le cellule staminali hanno la notevole capacità di differenziarsi in molti tipi cellulari diversi nell'organismo. Fungono da sistema di riparazione per il corpo. Teoricamente, possono dividersi senza limiti per rimpiazzare altre cellule.
Quando una cellula staminale si divide, ogni nuova cellula ha la capacità di rimanere una cellula staminale oppure di diventare un altro tipo di cellula con una funzione più specializzata. Questo promettente settore della scienza sta portando i ricercatori a indagare la possibilità di terapie basate sulle cellule per trattare malattie in vitro. La differenziazione delle cellule staminali embrionali avviene quando le cellule sono lasciate aggregare in coltura in sospensione.
In assenza di fibroblasti embrionali murini come cellule nutritizie e del fattore inibitore della leucemia, questi aggregati cellulari sono chiamati corpi embrionali. Il metodo della goccia sospesa è una procedura efficace per la differenziazione delle cellule staminali in corpi embrionali in vitro. Ciao, sono Sha Juan della divisione di Medicina Cardiovascolare di Stanford University.
Oggi vi mostreremo un procedimento per la differenziazione individuale delle cellule staminali embrionali in corpi embrionici mediante il metodo delle gocce manuali. Utilizziamo tipicamente questo metodo per differenziare le cellule staminali embrionali in cardiomiociti. Questa procedura include i seguenti passaggi: preparazione di una sospensione monocellulare di cellule staminali embrionali, generazione di colture a gocce manuali, trasferimento delle colture a gocce manuali in piastre a basso attaccamento ultraleggero e semina dei corpi embrionici su piastre rivestite con gelatina.
Ok, cominciamo. Il primo passo della procedura consiste nel preparare una sospensione monocellulare di cellule staminali embrionali. Poiché coltiviamo le nostre cellule staminali embrionali indifferenziate facendole crescere su fibroblasti embrionali di topo, dobbiamo staccare le cellule e separarle dai fibroblasti.
Per fare ciò, si procede alla tripsinizzazione delle cellule utilizzando procedure standard. Una volta completato il trattamento con tripsina, aggiungere il mezzo per cellule staminali embrionali di topo per neutralizzare la tripsina. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml.
Quindi frammentare le colonie cellulari aspirando e dispensando ripetutamente contro il fondo del tubo fino a ottenere una sospensione fine di cellule senza grumi visibili. Adesso centrifugare le cellule a mille giri al minuto per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in 10 ml di mezzo per cellule staminali embrionali di topo.
Trasferire la sospensione cellulare in una fiasca T 75 pre-ricoperta con gelatina 0,1% e incubare a 37 gradi con 5% CO2 per un'ora. Dopo un'ora, i fibroblasti si sono attaccati alla piastra, ma le cellule staminali rimangono nel mezzo. Aspirare il mezzo per raccogliere le cellule staminali.
Centrifugare le cellule a mille giri al minuto per cinque minuti ed aspirare il mezzo. Quindi aggiungere altri 10 ml di mezzo di differenziamento e risospendere le cellule mediante pipettaggio ripetuto finché non si ottiene una sospensione fine di cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Ora siamo pronti per coltivare la sospensione cellulare utilizzando il metodo della goccia sospesa. Per iniziare la coltura in goccia sospesa, utilizzare il mezzo di differenziamento per diluire la sospensione di cellule staminali fino a una concentrazione di 500 cellule per 20 microlitri. Successivamente, capovolgere il coperchio di una piastra per colture cellulari da 150 millimetri.
Quindi pipettare 20 microlitri della sospensione cellulare sulla superficie interna del coperchio della piastra. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 ml di PBS sulla piastra. Capovolgere rapidamente il coperchio della piastra e posizionarlo delicatamente sulla piastra per formare le gocce sospese.
Una volta posizionato il coperchio della piastra, trasferire con attenzione la piastra nell'incubatore. Lasciare le cellule indisturbate per due giorni. Al termine dell'incubazione, procederemo con il trasferimento della coltura a goccia sospesa in piastre a bassissima adesione.
Dopo due giorni, capovolgere con attenzione il coperchio della piastra, quindi aspirare 180 microlitri di mezzo di differenziamento fresco e aggiungere alcune gocce in una piastra da 96 pozzetti a adesione ultra bassa. Successivamente, raccogliere le gocce con una pipetta e trasferirle una alla volta nella piastra da 96 pozzetti. Collocare le piastre nell'incubatrice senza disturbarle per tre giorni.
I corpi embrionali continueranno a crescere assumendo una forma sferica. Al termine dell'incubazione, saremo pronti a piastrare i corpi embrionali, al fine di favorire la loro ulteriore differenziazione.
Li trasferiamo in una piastra da 48 pozzetti rivestita con gelatina. Per fare ciò, rivestiamo innanzitutto ogni pozzetto della piastra con 300 microlitri di gelatina allo 0,1%. Dopo aver aggiunto la gelatina, incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, aspirare la gelatina dalla piastra a 48 pozzetti. Quindi aggiungere 300 microlitri di mezzo di differenziamento a ciascun pozzetto. Ora, trasferire un corpo embrionale alla volta dalla piastra a 96 pozzetti alle piastre a 48 pozzetti rivestite con gelatina.
Di solito cambiamo il mezzo il giorno successivo e poi ogni due giorni per mantenere le cellule. Utilizziamo questo metodo per individuare protocolli migliori per la differenziazione delle cellule staminali embrionali. Nei cardiomiociti, abbiamo appena mostrato come eseguire la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo mediante colture a goccia sospesa.
Questo metodo è efficace perché il fondo arrotondato della goccia sospesa permette l'aggregazione delle cellule staminali embrionali, creando così un buon ambiente per la formazione dei corpi embrionali. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il numero di cellule staminali embrionali aggregate in una goccia sospesa può essere controllato variando il numero di cellule nella sospensione cellulare iniziale. È tutto.
Grazie per aver guardato. In bocca al lupo per il tuo esperimento.
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Panoramica
In questo video viene illustrata la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in corpi embrioidi mediante il metodo della goccia sospesa. Le cellule staminali hanno la capacità di svilupparsi in diversi tipi cellulari, funzionando come sistema di riparazione per l'organismo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Differenziamento cellulare
- Tecniche di coltura in vitro
Sfondo
- Le cellule staminali possono teoricamente dividersi senza limiti.
- Ogni nuova cellula può rimanere una cellula staminale o trasformarsi in una cellula specializzata.
- Questo settore della scienza sta portando a potenziali terapie basate sulle cellule.
- La differenziazione delle cellule staminali embrionali avviene in coltura in sospensione.
Scopo dello studio
- Dimostrare la differenziazione delle cellule staminali embrionali.
- Illustrare il metodo della goccia sospesa per l'aggregazione cellulare.
- Fornire informazioni sulle potenziali applicazioni terapeutiche.
Metodi Utilizzati
- Differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali di topo.
- Metodo della goccia sospesa per l'aggregazione cellulare.
- Tecniche di coltura in sospensione.
- Osservazione della formazione di corpi embrionoidi.
Risultati principali
- Formazione con successo di corpi embrioidali da cellule staminali.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo della goccia sospesa.
- Informazioni sul processo di differenziazione delle cellule staminali.
- Possibili implicazioni per le terapie basate sulle cellule.
Conclusioni
- Il metodo della goccia sospesa è efficace per la differenziazione delle cellule staminali.
- I corpi embrioidi possono essere formati in vitro a partire da cellule staminali embrionali di topo.
- Questa tecnica potrebbe favorire l'avanzamento della ricerca in medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La formazione controllata di corpi embrionidi consente una differenziazione in vitro riproducibile di cellule staminali embrionali di topo, supportando la validazione precoce di bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca sulla medicina rigenerativa. Il metodo della goccia sospesa fornisce un approccio scalabile e standardizzato per generare aggregati multicellulari omogenei, riducendo la variabilità negli screening fenotipici successivi e nello sviluppo di saggi. Questa tecnica aumenta l'affidabilità predittiva consentendo un controllo preciso del numero di cellule, facilitando la generazione costante di corpi embrionidi per la verifica di ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi di differenziazione delle cellule staminali e la validazione funzionale delle proteine bersaglio mediante la formazione controllata di corpi embrionoidi.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico fornendo un sistema riproducibile per valutare l'impegno verso linee cellulari specifiche e i marcatori precoci di differenziazione.
- Valore predittivo: Migliora la selezione del portafoglio consentendo una valutazione standardizzata dell'efficienza di differenziazione in seguito a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi di corpi embrioidi validati per lo screening di composti e la valutazione fenotipica successivi.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio mediante aggregazione controllata delle cellule in gocce sospese.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma e una valutazione costante dei composti in più pozzetti e piastre.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per le malattie generando corpi embrioidi che modellano i processi dello sviluppo precoce pertinenti alle terapie rigenerative.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica attraverso la produzione standardizzata di corpi embrioidi.
- Contenimento del rischio: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio consentendo una valutazione quantitativa della cinetica e dell'omogeneità della differenziazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo della goccia sospesa si inserisce nel percorso di scoperta, dalla differenziazione precoce delle cellule staminali fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, consentendo la generazione standardizzata di corpi embrioidi per lo screening terapeutico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'aggregazione controllata di cellule staminali embrionali murine in corpi embrionoidi.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio grazie alla formazione uniforme di corpi embrionoidi, facilitando risultati affidabili nei test di composti.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi come dimensione, numero e morfologia dei corpi embrionoidi per confrontare diverse condizioni di differenziazione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica generando corpi embrionoidi rilevanti per le malattie, utili per studi di de-risking meccanicistico e allineamento di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile in diversi progetti che richiedono la produzione standardizzata di corpi embrionoidi per saggi di differenziazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva negli esiti della differenziazione, validazione degli obiettivi e riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle cellule staminali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della formazione dei corpi embrionoidi tra diversi laboratori e esperimenti.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei percorsi di medicina rigenerativa.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su una qualità costante dei corpi embrionoidi e su una efficienza di differenziazione uniforme.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella preparazione di sospensioni cellulari singole e nella manipolazione di corpi embrionidi.
- È subordinato all'accesso a piastre a basso attaccamento, superfici rivestite di gelatina e mezzi di differenziamento standardizzati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo concentrazione cellulare, volume delle gocce e tempi di incubazione per ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento durante il trasferimento dei corpi embrionidi su diverse superfici di coltura per il differenziamento successivo.
- È limitato dalla necessità di una pipettatura manuale precisa e da una manipolazione accurata per evitare il danneggiamento dei corpi embrionidi durante i passaggi di trasferimento.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Introduction
2:06
Preparing Single Cell Suspension of Embryonic Stem Cells
3:46
Generating Hanging Drop Cultures
4:39
Transferring Hanging Drops to Ultralow Attachment Plates
5:17
Plating Embryoid Bodies onto Gelatin- Coated Plates
6:12
Conclusion
