Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

L'obiettivo generale di questa procedura è mescolare rapidamente due soluzioni per avviare una reazione biochimica su scala temporale di microsecondi. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando un miscelatore microfluidico. Il secondo passaggio consiste nell'unire un chip a un vetrino di copertura per sigillare i canali.

Successivamente, il chip viene montato su un collettore che contiene i serbatoi della soluzione. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire un'immagine della soluzione mescolata mediante microscopia a fluorescenza confocale. In definitiva, la reazione biochimica viene registrata su scala temporale di microsecondi convertendo la distanza lungo il canale di uscita in tempo.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il mescolamento stop-flow è che il mescolamento non è limitato dalla turbolenza e avviene in pochi microsecondi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ripiegamento delle proteine, ad esempio: quando si verifica il collasso idrofobico? A dimostrare la procedura sarà Ling Woo, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio, per iniziare la fabbricazione dei chip microfluidici per il mescolamento.

Pulire innanzitutto quattro wafer di silice FU da quattro pollici con una soluzione di piranha fresca, come descritto nel protocollo scritto allegato a questo video. Successivamente, utilizzare un forno per deposizione chimica da vapore a bassa pressione per applicare un rivestimento di polisilicio dello spessore di circa un micron per ogni 10 micron di profondità prevista dei canali microfluidici finali. Dopo ulteriore trattamento dei wafer, come descritto nel testo, applicare sui wafer uno strato spesso 900 nanometri di photoresist Z 52 14 mediante spin coating, quindi effettuare una cottura leggera a 90 gradi Celsius direttamente su una piastra riscaldata per un minuto oppure in forno a 110 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo aver allineato una maschera fotografica, crea un contatto diretto e sotto vuoto esponendo prima il photoresist alla luce UV per alcuni secondi. Successivamente, sviluppa il pattern nel photoresist come indicato nel protocollo scritto. Ispeziona le caratteristiche sul wafer mediante microscopio e procedi con una cottura finale a 115 gradi Celsius direttamente su una piastra riscaldante per due minuti.

Successivamente, sottoporre le wafer a DCU con plasma di Asher o di ossigeno per 2,5 minuti a una potenza RF di 100 watt. Utilizzando un etcher a ioni reattivi profondo, incidere lo strato di polisilice fino a raggiungere completamente la silice fusa sottostante. Rimuovere il fotoresist residuo e trattare la wafer come indicato nel testo.

Misurare la profondità di incisione per assicurarsi che attraversi completamente il rivestimento poli. Utilizzando un incisore a ioni reattivi profondi in grado di lavorare l'ossido, incidere la silice fusa fino a una profondità di circa 10 micrometri per ogni micrometro di spessore del rivestimento poli. Pulire la piastrina con l’Asher a matrice per quattro minuti, a una potenza RF di 100 watt, ed eliminare il polisilicio mediante un incisore a difluoruro di xeno prima di forare la piastrina; quindi applicare per spin-coating un nuovo strato di resist foto-sensibile di uno micrometro per proteggere i canali durante le successive manipolazioni.

Quindi montare il wafer con il lato delle strutture rivolto verso il basso su una piastra di vetro sacrificiale utilizzando Aqua Bond 55. Avere cura di mantenere il bonder privo di bolle, utilizzando un trapano a punta di diamante controllato da computer e una soluzione pulente micro 90. Questo impedisce che piccoli frammenti di vetro aderiscano ai canali, causando il intasamento del chip durante l'uso.

Procedere con la foratura, creando fori di entrata e di uscita in ogni chip. Risciacquare la wafer con acqua deionizzata utilizzando una siringa per iniettare acqua in ciascun foro. Successivamente, immergere in acqua saponata per un'ora dopo la rimozione della foto.

Resist e adesivo come descritto nel testo. Risciacquare la piastrina con acqua deionizzata e acqua calda saponata. Risciacquare nuovamente ogni foro con una siringa, evitando le strutture incise dopo aver fatto passare azoto sulla piastrina.

Continuare l'essiccazione in un forno a vuoto impostato a 120 gradi Celsius. Ispezionare i fori per assicurarsi che siano privi di impurità e ripetere i passaggi di pulizia se necessario. I seguenti passaggi devono essere eseguiti in camera bianca.

Misurare la profondità dei canali utilizzando un profilometro ottico o meccanico. Pulire la wafer e un vetrino di silice fusa come descritto nel testo in un ambiente a camera pulita. Asciugare accuratamente la wafer con gas azoto per almeno cinque minuti.

Quindi posizionare il wafer con il lato dei componenti rivolto verso l'alto su un impilato di tre o quattro salviette per ambienti puliti, appoggiate su una superficie dura e piana, come un piccolo vetro. Ripetere l'operazione con il vetrino di copertura. Prendere il vetrino di copertura per il bordo e capovolgerlo in modo che il lato lucidato sia rivolto verso il basso, sopra il wafer.

Allineare con cura i bordi piatti, abbassare delicatamente il vetrino sulla wafer e lasciarlo assestare; spostare orizzontalmente solo per regolare l'allineamento. Premere verso il basso con un dito al centro della wafer. Si dovrebbe osservare un fronte di legame che inizia a propagarsi verso l'esterno.

Se necessario, applicare una pressione aggiuntiva in altre posizioni intorno alla piastrina per far avanzare il fronte di legame. Dopo aver posizionato le piastrine sigillate in un forno ad alta temperatura programmato con il profilo termico indicato nel testo, tagliare la piastrina con una sega per dicing in singoli chip. Il collettore per contenere il chip miscelatore e le soluzioni può essere realizzato in materiale plastico come lexan o plexiglass, oppure in alluminio.

Per il controllo della temperatura, collegare il chip al collettore mediante piccole guarnizioni O-ring e fissarle in posizione con un anello di ritenzione che permetta una chiara visione ottica al centro del chip. Le scanalature per le O-ring devono essere più superficiali rispetto allo standard per garantire un buon accoppiamento senza applicare troppa pressione sul chip. Una volta montato il chip, aggiungere le soluzioni ai serbatoi centrale e laterali, avendo cura di eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate sul fondo dei pozzetti.

Posizionare la colletta su un microscopio invertito ed esaminare la regione di miscelazione attraverso l'oculare o l'uscita della telecamera. Una torcia a incandescenza posta sulla sommità della colletta fornirà una luce sufficiente. Utilizzare un colorante o una soluzione con alto indice di rifrazione nel canale centrale per visualizzare il getto.

Poiché i volumi utilizzati in questo miscelatore sono molto piccoli, il flusso può essere controllato mediante pressione d'aria applicata sopra le pozzette della soluzione. Per visualizzare il getto, iniziare con la pressione del canale laterale a zero libbre per pollice quadrato e aumentarla gradualmente fino a raggiungere la stessa pressione del canale centrale. Se uno dei canali laterali è ostruito, il getto verrà spinto contro una delle pareti del canale di uscita.

Se appare un'ostruzione visibile, può essere rimossa applicando pressione o vuoto al canale di uscita con una siringa. Se la proteina o altro materiale organico ostruisce il chip, può essere pulito immergendolo in soluzione piragna per tutta la notte. Portare un fascio laser rivestito in un microscopio di ricerca utilizzando uno specchio dicromatico posizionato all'interno o appena all'esterno del microscopio.

Allineare il laser in modo che il fuoco sia visibile nell'oculare o sulla telecamera approssimativamente vicino alla regione di mescolamento. La fluorescenza della proteina nel mescolatore viene raccolta dall'obiettivo e inviata attraverso uno specchio dicromatico, focalizzata da una lente su un foro stenopeico e immaginata su un contatore di fotoni. Scansionare il chip utilizzando uno scanner piezoelettrico in x e y per ottenere un'immagine della regione di mescolamento.

Scegliere una posizione sul getto e scansionare lungo X e Y per trovare il fuoco al centro del canale in direzione verticale. La profondità di campo del microscopio è molto inferiore alla profondità del canale, e la velocità di flusso è uniforme all'interno del canale tranne entro un micrometro dalle pareti. Pertanto, la risoluzione temporale della fluorescenza osservata è determinata principalmente dalle dimensioni del punto confocale.

Scansionare orizzontalmente all'interno del canale di uscita a incrementi di 100 micron lungo il getto, osservando per circa un millisecondo per ogni posizione. Spostare la piastra del microscopio di 80-90 micron lungo il getto per acquisire istanti successivi. In alternativa, la luce può essere rilevata da uno spettrografo e da un CCD dopo il divisore dicromatico, utilizzando una lente per focalizzare la luce sulla fessura di ingresso.

Poiché la raccolta dei dati è più lenta rispetto al contatore di fotoni, tipicamente il getto viene innanzitutto immaginato con il contatore di fotoni e successivamente vengono effettuate misurazioni lungo il getto con lo spettrografo. I dati provenienti dal contatore di fotoni vengono analizzati sommando da tre a cinque pixel intorno al getto in ogni posizione, al fine di creare un grafico dell'intensità in funzione della distanza. Il tempo viene calcolato a partire dalla distanza utilizzando una velocità calcolata in base alle pressioni applicate.

Come passo finale, analizzare i dati dello spettrografo utilizzando uno dei metodi descritti nel testo. Qui viene mostrato un grafico a curve di livello dell'intensità nella regione di mescolamento misurata dal contatore di fotoni. Lo sfondo nel canale di uscita al di fuori del getto dovrebbe essere prossimo al livello di rumore del rivelatore ed è tipicamente non sottratto.

Uno sfondo più elevato può indicare un allineamento scadente o che la proteina si sta attaccando alle pareti del canale. Al contrario, un getto che appare piegato o storto, specialmente nelle vicinanze della regione di miscelazione, indica un'incisione di scarsa qualità delle ugelle. Viene mostrato uno spettro risolto nel tempo della proteina ACell coenzima a binding protein o A CBP marcata con Alexa 4 88 e Alexa 6 47.

I rettangoli verde e rosso mostrano le lunghezze d'onda designate rispettivamente come canali donatore e accettore. Questi dati sono stati corretti per il fondo, al fine di rimuovere la carica oscura e il segnale del laser. Il segnale di fondo è stato registrato con la pressione del canale centrale pari a zero libbre per pollice quadrato.

Il tempo di mescolamento può essere misurato rilevando una reazione rapida che è molto più veloce della mescolanza, come il quenching della fluorescenza del triptofano da parte di ioduro di potassio. Poiché il getto è più piccolo della risoluzione ottica del microscopio, si verifica una forte diminuzione dell'intensità nella regione di mescolamento. Man mano che il getto si forma, questa risposta dello strumento può essere eliminata effettuando una misura di controllo in cui non avvengono cambiamenti nelle condizioni della soluzione.

Il rapporto tra esperimenti di miscelazione e non miscelazione della fluorescenza dell'amide di N-acetil triptofano è mostrato in questa figura. La linea indica la concentrazione prevista di ioduro di potassio ottenuta da modellizzazione e simulazioni multiphysics su console. Il tempo di miscelazione, misurato come il tempo necessario affinché la concentrazione diminuisca dell'80%, è di otto microsecondi.

Questo grafico mostra le variazioni del fret nella proteina A CBP dopo la diluizione del denaturante da sei molarità a 0,06 molarità. Questi dati non richiedono un esperimento di controllo. Poiché il fret è già un rapporto e la risposta dello strumento è già stata eliminata, il brusco salto vicino a T uguale a zero rappresenta un rapido cambiamento del segnale fret entro il tempo di mescolamento.

Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del ripiegamento proteico per esplorare le fasi iniziali della formazione della struttura proteica.