High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

L'obiettivo generale di questa procedura è scoprire nuovi composti che modulano l'attività dei canali del potassio rettificatori entranti. Questo viene raggiunto innanzitutto seminando cellule HK 2 9 3, inducibili con tetraciclina e che esprimono un canale KIR di interesse, in una piastra da 384 pozzetti. Il secondo passaggio consiste nel caricare le cellule con un colorante fluorescente marcatore del tallio denominato flu in two.

Successivamente, il colorante non incorporato viene rimosso dalle cellule mediante lavaggio e sostituito con un buffer di saggio contenente un veicolo controllo o composti in prova. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiunta di un buffer stimolante alle pozzette per avviare il flusso di tallio. Infine, un lettore di piastre a fluorescenza viene utilizzato per identificare i composti che modificano il movimento degli ioni tallio attraverso il canale KIR.Scadente.

Il principale vantaggio di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti, come l'elettrofisiologia con patch clamp manuale, è che consente all'investigatore di eseguire centinaia di esperimenti contemporaneamente e migliaia di esperimenti al giorno. Questo metodo permette all'investigatore di esaminare librerie di migliaia di piccole molecole per identificare modulatori dei canali del potassio rettificanti in entrata. Un giorno prima dell'esperimento di flusso del tallio, dissociare le cellule e quantificare la densità della sospensione cellulare come descritto nel manoscritto allegato. Successivamente, utilizzare il mezzo BH contenente il 10% di FBS dializzato per seminare 20.000 cellule monoclonali stabilmente trasfettate con un gene di canale KIR di interesse in ciascun pozzetto di una piastra BD PureCoat Amin ricoperta a 384 pozzetti, impiegando un Thermo Multi Drop Combi o una pipetta multicanale. Il giorno successivo, ispezionare la piastra al microscopio per assicurarsi che le cellule siano aderenti e uniformemente distribuite sul fondo dei pozzetti.

Quindi utilizzare un lavatore per micropiastre ELX 405 per sostituire il mezzo di coltura cellulare con il buffer HBSS per il saggio, aggiungendo 20 microlitri per pozzetto. Successivamente, preparare il flus nella soluzione di carico 2:00 AM D centrifugando brevemente il tubo per sciogliere 50 microgrammi di flus in due polvere in 100 microlitri di DMSO anidro.

Ora aggiungere 50 microlitri di una soluzione al 20% peso/volume di onic F1 27 in DMSO al colorante. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Quindi aggiungere 150 microlitri di flus alle 2:00 del mattino di onic F1 27 a 35 millilitri di HBSS per il saggio, tampone e mescolare delicatamente.

Successivamente, aggiungere 20 microlitri di buffer di carico del colorante in ogni pozzetto che contiene già 20 microlitri di HBSS assay.Buffer. Incubare le cellule a temperatura ambiente per circa un'ora mentre le cellule vengono caricate con il colorante. Preparare una piastra di stimolo al tallio sciogliendo frescamente 0,5 grammi di bicarbonato di sodio in 50 millilitri di buffer di stimolo al tallio 5 x.

Quindi aggiungere 50 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra in polipropilene da 384 pozzetti dopo che le cellule sono state caricate con flus alle 2:00 del mattino. Lavare la piastra con un lavatore per micropiastre ELX 405. Successivamente, aggiungere 20 microlitri oppure 40 microlitri di HBSS assay. Buffer nuovamente in ciascun pozzetto e la piastra è ora pronta per gli esperimenti.

Caricare le piastre con tallio e le piastre cellulari in un sistema di screening funzionale di farmaci Hema Matsu o in un lettore di piastre con imaging cinetico equivalente dotato di capacità integrate di dispensazione liquida e utilizzare filtri appropriati per coloranti a base di fluoresceina come flu oh four. Successivamente, impostare un protocollo di aggiunta singola per aggiungere 10 microlitri di cinque X Thallium series ai pozzetti corrispondenti della piastra cellulare contenente 40 microlitri di tampone per saggio HBSS. Quindi registrare la fluorescenza di base con una frequenza di campionamento di un hertz per almeno 10 secondi.

La fluorescenza da pozzetto a pozzetto dovrebbe essere uniforme e stabile su tutta la piastra una volta stabilite le condizioni ottimali di semina cellulare, lavaggio e carico. Nel frattempo, utilizzare il pipettatore integrato a 384 canali per aggiungere contemporaneamente il buffer stimolo di tallio in ogni pozzetto e continuare la registrazione per almeno due minuti, in modo da registrare la velocità e il picco dell'aumento di fluorescenza indotto dal tallio per l'analisi successiva. Nella serie successiva di esperimenti, valutare l'uniformità e la riproducibilità del saggio seminando un inibitore di controllo in ogni altro pozzetto di ciascuna colonna e riga di una piastra a 384 pozzetti e aggiungendo DMSO negli altri pozzetti come controllo del veicolo.

Utilizzare una pipetta multicanale. Preparare una piastra DMSO con il composto pipettando un inibitore del canale KIR bersaglio alla concentrazione determinata in precedenza, aggiungendo 80 microlitri per pozzetto e veicolo con lo 0,1% di DMSO in una piastra in polipropilene da 384 pozzetti. Questo passaggio viene eseguito aggiungendo l'inibitore noto a partire dal pozzetto A1, quindi alternando al pozzetto B2 e così via fino al pozzetto B24.

Ripetere questa procedura con DMSO partendo dal pozzetto B1 e così via fino al pozzetto A24. Caricare ora la piastra cellulare, la piastra del composto e la piastra con lo stimolo di tallio nel lettore di piastre. Impostare quindi un protocollo a due aggiunte per aggiungere 20 microlitri della serie di composti a concentrazione 2X nei pozzetti corrispondenti della piastra cellulare contenente 20 microlitri di tampone per saggio HBSS.

Aggiungere i composti alla piastra cellulare e incubarli per un massimo di 20 minuti a temperatura ambiente. Registrare il flusso di base in due fluorescenze per almeno 10 secondi. Quindi aggiungere 10 microlitri di tampone al tallio 5x in ogni pozzetto della piastra cellulare.

Ripetere l'esperimento in tre giorni consecutivi per stabilire la riproducibilità dei risultati. Utilizzare il flusso di tallio nelle cellule trattate con DMSO e con il farmaco per calcolare un valore di Z prime. Una misura statistica della variabilità da pozzetto a pozzetto tra le due popolazioni di pozzetti consente di calcolare Z prime utilizzando questa formula basata sulle medie e sulle deviazioni standard di P e N, dove P è il valore di flusso non inibito e N è il valore di flusso completamente inibito.

Un saggio con valori ZPrime maggiori o uguali a 0,5 in tre giorni diversi è considerato adatto per lo screening ad alto rendimento. Queste figure mostrano alcuni esempi di mappe di semina cellulare utilizzate in diversi tipi di esperimento. Le posizioni dei pozzetti contenenti cellule non indotte o indotte da tetraciclina sono indicate con colori diversi.

Questa figura mostra la mappa della piastra sorgente utilizzata per determinare la concentrazione ottimale di tallio per lo sviluppo del saggio e lo screening dei composti. Il gradiente di colore rappresenta una serie di diluizioni triplicate che varia dal 100% allo 0,002% di tallio, e qui è mostrata una mappa rappresentativa dell'intensità di fluorescenza con colori che passano dal freddo al caldo, indicanti valori di flusso di tallio da bassi ad alti. La mappa di semina delle cellule mostrata, con l'adattamento a una funzione logistica a quattro parametri alla CRC del tallio, viene utilizzata per determinare un valore EEC 80 pari al 15% di tallio.

Questa figura mostra la mappa della piastra sorgente utilizzata per determinare la tolleranza al DMSO in un saggio. Le colonne uno e 24 contengono solo tampone per saggio, mentre il gradiente di colore indica la serie di diluizioni doppie che varia dal 10% al 0,01% di DMSO ed è rappresentata una mappa tipica dell'intensità di fluorescenza con valori bassi di flusso del tallio indicati in blu più scuro. I valori medi di flusso del tallio registrati nei pozzetti contenenti le concentrazioni indicate di DMSO sono riassunti qui.

Ora questa figura mostra la mappa della piastra sorgente utilizzata per stabilire le curve di risposta alla concentrazione per gli inibitori noti di un canale KIR. Ciascun composto è indicato con un colore diverso ed è generalmente distribuito in serie di diluizioni triplicate. Qui viene mostrata una mappa rappresentativa dell'intensità di fluorescenza, e questa figura mostra l'inibizione dipendente dalla dose del flusso di tallio da parte di un inibitore, dopo lo sviluppo e l'ottimizzazione.

L'analisi del flusso di tallio può essere utilizzata anche per eseguire una varietà di saggi di farmacologia di routine. L'analisi del flusso di tallio è stata precedentemente adattata per l'uso con canali del potassio voltaggio-dipendenti e ligando-dipendenti, canali cationici non selettivi e persino trasportatori del potassio. Non dimenticare che lavorare con il tallio può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di guanti e lo smaltimento appropriato dei rifiuti, durante l'esecuzione di questa procedura.