A Step-by-step Metodo per la ricostituzione di un Transporter ABC in particelle lipidiche Nanodisc

L'obiettivo generale di questa procedura è incorporare un trasportatore A, b, C. In questo caso, il trasportatore di maltosio malf GK due in particelle solubili di nano-dischi di membrana. Questo viene ottenuto mescolando innanzitutto la proteina dello scaffold di membrana MSP con il trasportatore e la quantità corretta di lipidi in micelle di detergente.

Il secondo passaggio consiste nell'aggiungere perle di polistirene e agitare delicatamente la miscela per tutta la notte; il detergente viene progressivamente assorbito sulle perle, consentendo la formazione delle particelle di nano-disco. Successivamente, le perle vengono rimosse per sedimentazione. L'ultimo passaggio prevede la separazione dei dischi correttamente formati dagli aggregati e dalle proteine scaffold non assemblate mediante cromatografia a filtrazione in gel.

Infine, la qualità dei dischi viene valutata mediante elettroforesi su gel nativo o spettroscopia di scattering della luce. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come i liposomi, è che le proteine di membrana e i dischi sono perfettamente solubili in soluzione acquosa. Inoltre, i domini proteici sono ora accessibili da entrambi i lati.

Dato che ora non esiste più un compartimento della membrana, utilizzando proteine scaffold di membrana di diverse lunghezze, sono riuscito a intrappolare e studiare i diversi stati conformazionali delle proteine di membrana. Ancor più importante, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della proteomica di membrana, come l'identificazione di nuovi partner di legame dei trasportatori a, b, C. In effetti, le implicazioni di questa tecnica si estendono ulteriormente verso la terapia, poiché possono favorire la scoperta di attivatori o inibitori di proteine di membrana e recettori.

Sebbene questo metodo possa sembrare semplice, è necessario prestare attenzione nella scelta del rapporto corretto tra proteine e lipidi. In generale, le persone nuove a questo metodo possono incontrare difficoltà nel calcolare il rapporto molare corretto o nell'eseguire i controlli adeguati per garantire la qualità della preparazione. Pertanto, una dimostrazione visiva di questo metodo risulta molto utile per consentire a uno studente principiante di apprendere i vari passaggi e le potenziali difficoltà.

Per iniziare, esprimere la MSP con tag esa istidina in *E. coli* ceppo BL21(DE3) a partire dal plasmide pMSSP1D1; indurre la produzione proteica quando la densità ottica misurata a 600 nanometri è pari a circa 0,5, per tre ore a 37 gradi Celsius. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ri-sospendere il pellet nel buffer TSG10 contenente 100 micromolare PMSF; lisare le cellule con un pressa francese per tre passaggi a 8.000 psi. Rimuovere il materiale insolubile mediante centrifugazione a 5.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, isolare la frazione solubile contenente la MSP mediante ultracentrifugazione a 125.000 ×g per 45 minuti.

Purificare la MSP mediante cromatografia a scambio ionico al nichel utilizzando circa 1,5 millilitri di nickel sepharose ad alte prestazioni nel buffer TSG 10. Rimuovere i contaminanti con il buffer TSG 10 contenente 50 millimoli di ILE. Eluire la MSP con il buffer TSG 10 contenente 600 millimoli di imidazolo dopo la dialisi.

La proteina purificata nel tampone TSG 10 MSP può essere conservata a meno 70 gradi Celsius e a una concentrazione proteica di circa 10-15 milligrammi per millilitro. Il complesso MALF GK due, con marcatura his sul terminale C di MAL K, viene espresso da un plasmide. PED 22 FG K coltivato nel ceppo di e coli BL 21 DE tre induce la produzione proteica quando la densità ottica misurata a 600 nanometri è di circa 0,5 con 0,2% L Arabs per tre ore a 37 gradi Celsius, successivamente alla lisi cellulare e alla centrifugazione.

Come in precedenza, sospenderemo il pellet di membrane nel buffer TSG 20 fino a una concentrazione finale di cinque milligrammi per millilitro. Successivamente, solubilizzare il materiale con GDM al 1% peso/volume per tre ore a quattro gradi Celsius con agitazione delicata. Rimuovere il materiale insolubile mediante ultracentrifugazione come per la purificazione di MAL FTK due.

Quindi raccogliere il surnatante contenente il complesso mal FTK due solubilizzato e purificare nuovamente mediante cromatografia a scambio cationico con nichel. Ulteriormente purificare il complesso mediante cromatografia di filtrazione su gel in tampone TSGD su una colonna SUEx 200, HR 10/300 a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto. Per preparare i fosfolipidi, un estratto lipidico totale di e coli disciolto in cloroformio viene suddiviso in aliquote da 1000 anomal in provette microfiche con tappo a vite; evaporare il solvente sotto un flusso delicato di azoto ed essiccare ulteriormente durante la notte in vuoto.

Successivamente, essiccare, sciogliere il film lipidico nel buffer TS ad una concentrazione finale di cinque NMO e agitare energeticamente con vortex, quindi sottoporre a sonica pulsata cinque volte per circa cinque secondi. I lipidi disciolti appariranno leggermente opachi a causa della loro scarsa solubilità nel buffer TS acquoso, ma dovrebbero rimanere in sospensione. Aggiungere DDM fino ad una concentrazione finale dello 0,5%. A questo punto, la soluzione diventerà limpida; porre la miscela lipidica in un bagno a ultrasuoni e sottoporre nuovamente a sonica pulsata cinque volte per circa cinque secondi.

La miscela lipidica può essere conservata a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per preparare le bio perle, versare circa da 10 a 15 millilitri di bio perle in un tubo da 50 millilitri. Per prima cosa, lavare le perle con 50 millilitri di metanolo al 100%.

Lasciare sedimentare le perle per gravità, quindi versare delicatamente la soluzione. Ripetere il processo una volta con metanolo e poi due volte ciascuno con etanolo al 95%, acqua milli Q e infine tampone TS. Iniziare la costituzione nano disgregata diluendo il MSP nel tampone TSGD fino alla concentrazione finale di circa sette milligrammi per millilitro o 0,3 millimolari.

Per garantire un esperimento di successo, è importante scegliere i rapporti corretti tra lipidi e proteine da mescolare. Mescolare circa due M del complesso purificato malf GK due in un rapporto proteina a MS P a lipidi di uno a tre a 60 nel buffer TSGD per un volume finale di 300 microlitri; qui, un campione di lipidi in eccesso nel rapporto di uno a tre a 400 viene preparato anche come controllo negativo. Aggiungere 50 microlitri di sospensione di bio pallini al tubo e incubare la miscela tutta la notte su un tavolo oscillante a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, far sedimentare i pallini per gravità. Una volta che i pallini si sono depositati, prelevare la soluzione attraverso una punta stretta per evitare il più possibile i bio pallini.

Rimuovere i precipitati più grandi mediante ultracentrifugazione a 100.000 ×g per 20 minuti. Procedere quindi alla purificazione dei dischi mediante cromatografia di esclusione molecolare, come eseguita in precedenza nel tampone TSG 10. Successivamente, iniettare un Eloqua sulla stessa colonna di filtrazione su gel per verificare la stabilità del preparato.

Quindi unire le frazioni contenenti i dischi. La qualità della preparazione viene valutata mediante elettroforesi su gel nativo. Analizzare un micromolare di nano dischi per valutare la qualità della ricostruzione.

Valutare anche il legame di mal E al complesso mal ftk due ricostruito in nanodischi. Dopo l'elettroforesi, colorare il gel con blu di kumasi per 10 minuti e lasciare in incubazione per circa un'ora. Per eseguire la diffusione dinamica della luce o DLS, purificare prima i nanodischi mediante cromatografia di filtrazione in gel come in precedenza, utilizzando una colonna SUEx 200 HR dieci trecento a una velocità di flusso di 0,1 millilitri al minuto.

Raccogliere le frazioni contenenti i nano-dischi e concentrarle a circa 10 milligrammi per millilitro utilizzando un filtro centrifugo AmCon. Quindi filtrare il campione due volte. Eseguire l'analisi mediante DLS utilizzando uno strumento Dynapro Nano Star in una cuvetta di quarzo con volume interno di un microlitro.

Utilizzando un software dinamico per stimare il diametro e il peso molecolare delle particelle, determinare l'attività di mal FTK nei due nano-dischi ricostruiti mediante un saggio colometrico. Inizialmente mescolare un micromolare di dischi purificati e un millimolare di a TP con quantità crescenti di mal e. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi misurare il rilascio di fosfato inorganico a 660 nanometri. Confrontare la quantità di fosfato rilasciato con una curva standard generata utilizzando una soluzione standard di fosforo. I nano dischi vengono purificati mediante cromatografia a filtrazione su gel.

Il cromatogramma mostra che la maggior parte dei dischi ricostruiti eluisce come un singolo picco, mentre i dischi preparati con un eccesso di lipidi eluiscono nel volume vuoto e come una serie di picchi larghi. La qualità della preparazione dei dischi viene ulteriormente analizzata mediante elettroforesi su gel nativo: i dischi ricostruiti con una quantità limitata di lipidi migrano come una banda nitida sul gel nativo, mentre quelli ricostruiti in presenza di un eccesso di lipidi migrano come strisce sfumate. L'analisi mediante DLS mostra che la popolazione di dischi è omogenea con un raggio medio di 5,0 nanometri. Sulla base dell'approssimazione DLS, i dischi ricostruiti hanno un peso molecolare apparente di 215 chilodalton. I campioni ricostruiti in presenza di eccesso di lipidi mostrano raggi ampiamente distribuiti intorno ai 100 nanometri, valore tipico per campioni non omogenei.

L'attività del complesso MAL FTK due viene valutata misurando la velocità di idrolisi del TP e l'affinità per partner interagenti come la proteina legante il maltosio, MAL E, la proteina legante il maltosio. MAL E si lega con alta affinità al trasportatore MAL FTK due mediante elettroforesi su gel non denaturanti. È possibile rilevare un complesso tra MAL E e MAL FTK due; qui viene mostrata la stimolazione dell'attività MAL KA TPA da parte di MAL E in funzione della concentrazione di MAL E.

La preparazione del nano disco è relativamente semplice, ma piccole deviazioni dalle condizioni ottimali possono portare ad aggregazione irreversibile delle proteine; una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di due giorni. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare l'importanza della scelta di un rapporto proteina-lipidi corretto, poiché un eccesso di lipidi porterà alla produzione di grandi particelle polidisperse simili a liposomi. È pertanto fondamentale analizzare attentamente la qualità del materiale ricostruito utilizzando tecniche diverse dalla filtrazione su gel, come la spettroscopia di scattering della luce, l'ultracentrifugazione analitica o, più semplicemente, l'elettroforesi nativa su gel.

Ricordare che il tipo di fosfolipide che incorpora il disco, così come quello della proteina dell'impalcatura della membrana, può influenzare l'efficienza della ricostruzione. Dopo aver visto questo video, speriamo che abbiate acquisito una buona comprensione di come generare nano-dischi solubili e omogenei contenenti la proteina di membrana di vostro interesse. Buona fortuna con i vostri esperimenti.