Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell'angiogenesi

Lo scopo del seguente esperimento è identificare la dinamica cellulare spaziale e temporale coinvolta nell'angiogenesi, definita come la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da quelli preesistenti. Utilizzando un modello semplice e riproducibile, si induce inizialmente l'angiogenesi mediante l'esteriorizzazione temporanea del mesentere del ratto e si prelevano tessuti mesenterici in diversi momenti successivi alla stimolazione. Successivamente, si etichettano immunoistochimicamente le sezioni di tessuto.

Ad esempio, utilizzare un marcatore per cellule endoteliali per visualizzare l'intera vascolarizzazione rimodellata all'interno di un tessuto e creare una visualizzazione bidimensionale essenziale delle reti microvascolari in crescita. Questo modello è attraente perché produce un aumento significativo di molteplici parametri angiogenici nel complesso in un periodo di tempo relativamente breve. La visualizzazione delle reti a livello di singola cellula e la correlazione di questi parametri con l'etichettatura multicellulare si sono rivelate estremamente utili nell'identificazione di nuovi fenotipi cellulari coinvolti nella formazione di nuovi capillari.

Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la dinamica cellulare coinvolta nella crescita della rete microvascolare. Tali domande includono il momento e il luogo in cui specifiche cellule sono presenti durante il processo di formazione dei capillari. I principali vantaggi di questo metodo sono la sua semplicità, il ridotto intervento chirurgico richiesto e la capacità di generare una risposta angiogenica robusta in un periodo di tempo relativamente breve.

Inoltre, sfrutta il mesentere di ratto, un tessuto che consente l'osservazione di una rete intatta fino al livello della singola cellula. Nella nostra esperienza, è molto facile da apprendere e quindi riproducibile da un ricercatore all'altro, come dimostrato dalla procedura. Oggi Peter Stapler, uno studente laureato del nostro laboratorio, si preparerà per l'intervento chirurgico secondo quanto descritto nel testo allegato.

Dopo aver rasato la zona addominale del ratto, posizionare l'animale anestetizzato in posizione supina su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea; pulire la zona addominale alternando passate di tamponi sterili imbevuti di alcol al 70% e iodio, circa un pollice al di sotto dello sterno. Praticare una piccola incisione longitudinale lungo la cute e quindi lungo la linea alba. Posizionare il campo operatorio pre-tagliato sulla sezione addominale in modo che l'apertura sia allineata con l'incisione. Applicare delicatamente pressione attorno all'incisione per esporre l'intestino tenue. Con applicatori di cotone, estrarre delicatamente un tratto dell'intestino tenue, appoggiando il mesentere sulla piastra di plastica contenente soluzione salina sterile, e individuare l'ileo.

Individuare da sei a otto finestre mesenteriche vascolarizzate, la sottile membrana traslucida situata tra le coppie arterovenose, che irrora l'intestino tenue. Registrare l'ora di inizio dell'esteriorizzazione e impostare un timer di 20 minuti. Contrassegnare con un punto di sutura sterile numero 7-0 le due finestre mesenteriche situate più centralmente, nell'area adiposa vicina all'intestino.

Ricaricare intermittente la soluzione salina nella piastra di Petri utilizzando una siringa sterile da cinque millilitri per garantire che il tessuto rimanga immerso e umido. Trascorso il periodo di esteriorizzazione, riposizionare il mesentere all'interno della cavità addominale. Chiudere il muscolo addominale con una sutura monofilamento cinque zero in un pattern interrotto.

Quindi chiudere la cute con quattro punti di sutura monofilamentosa zero in un modello interrotto, pulire l'area di sutura con tamponi alternati utilizzando garza sterile imbevuta di alcol al 70% e iodio per disinfettare, applicare un gel lubrificante su entrambi gli occhi del ratto e restituirlo alla gabbia per il recupero. Nel giorno di interesse, dopo la stimolazione, anestetizzare ed eutanasia il ratto seguendo le linee guida istituzionali. Riaprire quindi la cavità addominale e coprire la zona addominale con un pezzo di pellicola di plastica. Ora estrarre delicatamente l'intestino tenue e localizzare le due finestre marcate utilizzando pinzette e micro forbici.

Rimuovere ciascuna delle finestre mesenteriche esteriorizzate, includendo un margine di tessuto adiposo. Evitare di tagliare le coppie arteria-vena presenti nel margine adiposo delle finestre, al fine di ridurre al minimo il possibile riempimento ematico delle stesse. Inoltre, limitare al minimo i tagli attraverso l'intestino che potrebbero causare fuoriuscita di contenuto intestinale.

Il contatto con le finestre richiede di immergere immediatamente ciascuna finestra in PBS. Successivamente, utilizzare pinzette per stendere i tessuti su vetrini carichi positivamente. Montare due tessuti per vetrino. Dopo che i tessuti si sono parzialmente asciugati, rimuovere il grasso in eccesso con una lama di bisturi.

Fissare i campioni in metanolo per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius ponendoli nel congelatore. Asciugare sotto vuoto i vetrini per rimuovere la soluzione tampone in eccesso. Inoltre, delimitare i tessuti con una penna al paraffina per evitare il flusso incontrollato delle soluzioni anticorpali lontano dal tessuto.

Ora aggiungere per gocciolamento circa 200 microlitri di soluzione dell'anticorpo primario diluito per coprire completamente il tessuto. Incubare per un'ora a temperatura ambiente, quindi lavare i tessuti con PBS contenente lo 0,1% di sapina con tre ricambi di tampone. Successivamente, aggiungere la soluzione dell'anticorpo secondario streptavidina perossidasi e incubare a temperatura ambiente per un'ora; dopo tre lavaggi, incubare i campioni nel reattivo Vector Nova Red per 15 minuti.

Sciacquare con acqua per montare i vetrini. Immergere nell'etanolo al 95% dieci volte, seguito da passaggi successivi di disidratazione. Lasciare asciugare i vetrini, coprendo i tessuti con uno strato sottile; regolare la quantità e la posizione dei coprioggetti dopo l'essiccazione a vuoto e la marcatura.

I vetrini. Coprire i campioni di tessuto con soluzione diluita di anticorpo primario. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Lavare tre volte con PBS contenente 0,1% di saponina, per 10 minuti ogni lavaggio. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario e incubare per un'ora. Eseguire i lavaggi in PBS con 0,1% di saponina, montare i vetrini in PBS con glicerolo e sigillare con smalto per unghie.

Qui illustriamo la modifica di una comune piastra di Petri per utilizzarla come campo operatorio. È stata usata argilla modellabile gialla per fornire una superficie liscia attraverso la quale far passare il mesentere dal foro pre-tagliato. Ancora una volta, le finestre mesenteriche mostrate qui nel campo operatorio durante il periodo di esternazione sono definite come le sottili membrane traslucide poste tra le coppie arteria-vena che irriganano l'intestino in questa sede.

L'etichettatura con PCAM identifica tutti i tipi di vasi lungo la gerarchia delle reti microvascolari in rimodellamento in specifici momenti temporali successivi all'esternalizzazione. Queste immagini possono essere utilizzate per quantificare parametri angiogenetici in determinati punti temporali. Dopo la stimolazione.

L'etichettatura con PCAM permette di distinguere tra arteriole e vene. Si noti che le arteriole di alimentazione presentano tipicamente diametri più piccoli e una morfologia allungata delle cellule endoteliali rispetto alle vene associate. Le caratteristiche tipiche delle reti rimodellate includono l'area vascolarizzata, la formazione di nuovi capillari (sprouting) e la densità vascolare.

La quantificazione di queste diverse metriche angiogeniche caratterizza l'andamento temporale della crescita della rete. La formazione di nuovi capillari da vasi preesistenti raggiunge il picco tra il terzo e il quinto giorno e ritorna al livello non stimolato entro il decimo giorno. Questo aumento transitorio nella formazione di nuovi capillari è seguito, nel nostro laboratorio, da un incremento dell'area vascolarizzata e della densità vascolare.

Questo sistema modello è stato utilizzato per identificare nuovi cambiamenti fenotipici cellulari in specifici punti temporali durante questo processo di rimodellamento. La colorazione con etichettatura PCA immunofluorescente evidenzia le cellule endoteliali, mentre l'etichettatura della tubulina beta di classe tre colora di verde i nervi e i parassiti lungo i vasi angiogenetici. In modo interessante, nei tessuti non stimolati, l'espressione della tubulina beta di classe tre è specifica per i nervi.

Al contrario, durante il picco della formazione di nuovi capillari, le cellule perivascolari esprimono la tubulina beta di classe tre. Questo tipo di risultato evidenzia l'utilizzo di questo modello angiogenico semplice e robusto per identificare nuovi tipi cellulari coinvolti nel processo angiogenico. Entro il giorno 10, il profilo di espressione della tubulina beta di classe tre inizia a ripristinare lo scenario osservato in condizioni non stimolate.

Questo modello potrebbe inoltre essere potenzialmente utilizzato per studi sulla linea cellulare. La fattibilità dell'incorporazione cellulare nei tessuti mesenterici in rimodellamento è supportata da questi studi preliminari, nei quali cellule del midollo osseo pre-etichettate o cellule staminali mesenchimali sono state sovrafuse su finestre mesenteriche durante il periodo di esposizione esterna di 20 minuti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il nostro modello di interiorizzazione del mesentere del ratto per indagare la dinamica cellulare coinvolta nella crescita della rete microvascolare.

Questa semplice tecnica può essere eseguita in circa 45 minuti fino a un'ora. Ricordare che è fondamentale manipolare con delicatezza il mesentere ed evitare di perforare qualsiasi vaso dopo un intervento chirurgico. L'etichettatura immunoistochimica può essere eseguita per identificare diversi tipi cellulari lungo i vasi sanguigni.

È inoltre possibile effettuare la marcatura per i vasi linfatici e i nervi. Questo ci consente di studiare non solo le modifiche fenotipiche cellulari coinvolte nell'angiogenesi, ma anche la coordinazione tra angiogenesi, neurogenesi e linfangiogenesi.