Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di consentire misurazioni ripetute della conducibilità idraulica o della permeabilità all'acqua delle pareti dei microvasi Ular nel mesenario di ratto in condizioni sperimentali controllate. Ciò si ottiene incannulando un micro vaso alare per consentire l'impostazione delle pressioni oncotiche e idrostatiche nel lume e per consentire il controllo preciso della composizione chimica dell'otto abbondante e dell'otto. Successivamente, il vaso viene occluso e i globuli rossi sospesi nell'otto PERFUSE, che fungono da marcatori di flusso, possono essere osservati muoversi nel lume come indicatori dello scambio di fluidi transvascolari.

Quindi la posizione e la velocità dei globuli rossi marcatori vengono registrate verso il sito di occlusione o lontano dal sito di occlusione. Infine, l'occlusione viene rilasciata e ripetuta per ulteriori misurazioni o il vaso viene rec. Le misurazioni vengono ripetute in condizioni modificate.

In definitiva, è possibile effettuare misurazioni accoppiate della conducibilità idraulica in condizioni di controllo e di prova per consentire l'indagine più diretta dei fattori che regolano i micro recipienti. Permeabilità. Un vantaggio della tecnica di Landis modificata per studiare la regolazione della permeabilità capillare è la fase di perfusione. La microperfusione consente di misurare la permeabilità della parete dei microvasi in condizioni in cui la composizione di PERFUSE otto, l'area di scambio e la pressione dei microvasi sono tutte controllate direttamente.

Questo metodo può affrontare questioni riguardanti i meccanismi cellulari e molecolari di regolazione della permeabilità nei microvasi che sono rappresentativi di organi intatti e può fornire un confronto con i risultati di monostrati endoteliali in coltura, che spesso vengono utilizzati per studiare i dettagli dei meccanismi molecolari. A dimostrare il nostro protocollo è Joyce Clark, la nostra responsabile di laboratorio. Joyce è stata responsabile di molti dei miglioramenti apportati a questo protocollo durante il suo periodo qui come responsabile del laboratorio.

Per iniziare, utilizzare un estrattore elettronico per formare diversi tubi capillari di vetro silicato di boro puliti in metà affusolate, ciascuna con una lunghezza della punta di circa un centimetro utilizzando una mola azionata ad aria e una carta abrasiva da 0,5 micron bagnata in acqua e un micro portapipette impostato a un angolo di 30 gradi dallo smusso orizzontale, le micro pipette. Dopo aver lavato e asciugato le micropipette secondo il protocollo di testo, selezionare micro pipette con un'apertura lunga circa 50 micron e un rapporto lunghezza/larghezza dello smusso compreso tra 3,1 e 3,5. Dovrebbero anche avere una punta nettamente affusolata, che aiuta a penetrare le dure fibre di collagene nel mesentere.

Per fare i contenitori, tenere brevemente un capillare di vetro tirato non smussato vicino a una microfiamma per formare un'estremità smussata. Ripetere l'operazione per creare diversi sistemi di ritenuta e conservare in una scatola priva di polvere. Quindi eseguire micro occlusioni tenendo un tubo capillare tirato non smussato ad angolo sotto una microfiamma e utilizzare un adattatore per tubo o una micropipetta rotta per piegare delicatamente il tubo a circa quattro millimetri dalla punta con un angolo vicino a 120 gradi.

Per quanto riguarda l'asta, è importante che la punta non sia né sigillata nella fiamma né rotta. Dopo aver anestetizzato un ratto e sistemato il tessuto mesentario e l'intestino secondo il protocollo di testo, posizionare il vassoio per animali sul tavolino del microscopio in modo che il mesentario sia visibile attraverso gli oculari. Posizionare un'ala gocciolante alimentata a gravità di una soluzione di anello di mammifero per una super fusione continua.

Il mesenario utilizza quindi una garza per tenere l'intestino in posizione, aiutare a trattenere l'umidità e rimuovere i suoneria in eccesso dalla superficie, regolare il flusso e aspirare l'effluente per mantenere uno strato costante di suse otto, identificare i microvasi flar bersaglio, che sono segmenti non ramificati a valle del flusso convergente e uno o due rami distali ai veri capillari. Trova un vaso non ramificato con un flusso sanguigno vivace e privo di globuli bianchi che si attaccano alla parete del vaso. Possedere. Posizionare i microrecipienti di prova al centro del campo del microscopio e spostare il sistema di ritenuta in posizione vicino al sito di incannulamento prescelto.

Per riempire la micropipetta, aspirare otto perfusi e lavare gli eritrociti in una siringa preparata secondo il protocollo di testo, assicurarsi che non ci siano bolle nel tubo. Far avanzare il tubo nell'estremità più grande della micropipetta fino a quando non si appoggia alla regione conica. Applicare una leggera pressione rapida sullo stantuffo della siringa per riempire il puntale della micropipetta.

Un piccolo ruscello o goccia apparirà sulla punta quando è piena. Mentre si estrae il tubo, premere delicatamente lo stantuffo per riempire lo stelo della micropipetta. Quindi, rimuovere le piccole bolle nell'asta strofinandolo delicatamente.

Quindi posizionare la micropipetta in un portapipetta con una porta laterale che consente un collegamento continuo del fluido a un manometro dell'acqua. Assicurarsi che il supporto, che è collegato a un azionamento idraulico e a un micromanipolatore, sia posizionato con un leggero angolo orizzontale in modo che il bordo del cono della micropipetta non colpisca il budello o il vassoio. Utilizzando una siringa o un bulbo di gomma riempito d'acqua, regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta modificando l'altezza del fluido nella colonna d'acqua del manometro a circa 40 centimetri di acqua sopra il mesentere.

Prima di posizionare la micropipetta riempita al microscopio, premere delicatamente il sistema di ritenuta sul tessuto vicino ai micro vasi, applicando una forza sufficiente per afferrare il tessuto, tirare leggermente indietro il sistema di contenzione, allungando il tessuto in linea con i micro vasi in modo che le sollecitazioni nelle fibre di collagene mesenterico siano allineate con il vaso. Allineare la micropipetta con il recipiente e abbassarla in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di incannulamento scelto e abbassarla sul tessuto in modo che ostruisca parzialmente il flusso all'interno del vaso, ma non lo occluda.

Utilizzando l'azionamento idraulico, incannulare il recipiente inserendo lentamente la punta della pipetta nel lume del recipiente, facendo attenzione a non spingere la punta attraverso l'altro lato del recipiente. Quando la micropipetta entra nel lume, l'otto perfuso lava rapidamente il sangue dal lume del vaso ed entra in circolazione. Abbassare la pressione di perfusione regolando il manometro fino a quando i globuli rossi oscillano delicatamente nel lume del vaso.

Questo determina la pressione di equilibrio, che misura la pressione idrostatica dei microvasi o PC all'estremità distale del segmento dei microvasi. Mantenere la perfusione dei vasi al di sopra di questa pressione di equilibrio per eseguire la micro occlusione. Posizionare il bloccante sopra il recipiente perfuso vicino al bordo inferiore del campo del microscopio utilizzando video e audio.

Registra verbalmente la posizione del sito del blocco come si vede nel pezzo I rosso. Il sito del blocco è 57 Con la punta del bloccante posizionata appena sopra il micro recipiente. Utilizzare il controllo Z fine del micromanipolatore per abbassare delicatamente il bloccante fino a quando il flusso nel recipiente non è occluso.

Utilizzare l'audio per annotare la pressione del manometro. La pressione è 50. Quindi applicare l'occlusione per tre-10 secondi e rilasciare.

Per ripristinare la perfusione libera, spostare il sito di blocco lungo il recipiente verso la punta della pipetta con incrementi da cinque a 10 micron, eseguendo non più di tre o cinque occlusioni in ciascuna posizione per evitare danni alla parete del vaso nel sito di blocco. Analizza i dati secondo il protocollo di testo. Questo corso temporale misura le variazioni della conducibilità idraulica o LP.In un micro recipiente razionale incannulato con successo con quattro otto perfusi.

L'entità del LP a pressione costante è stata utilizzata per misurare i cambiamenti nei micro recipienti. Permeabilità della parete quando perfuso con l'1% di BSA come controllo rispetto a 10 molari dell'agente infiammatorio Brady Kinin o bk. Come mostrato qui, BK ha causato un aumento transitorio di LP che è tornato ai livelli di controllo entro 10-15 minuti.

Dopo aver ristabilito i livelli basali con 1% BSA 10 nanomolare. BK è stato riperfuso insieme a una scena di pH micromolare, un fosfato o S un P.I risultati indicano che S e P hanno attenuato significativamente la risposta a bk. Per alcuni disegni sperimentali, è importante stimare sia il coefficiente di riflessione della soluzione per una macromolecola che la lp.

Ciò si ottiene al meglio misurando la JV a pressioni multiple su ogni singolo micro recipiente. Questo esperimento ha stimato sia la LP che la pressione oncotica efficace del 5% di albumina nell'ottavo studio PERFUSE quando non c'era albumina nel tessuto che circonda i micro vasi. JV su S è stato misurato a tre diverse pressioni e tracciato. Qui.

L'LP è la pendenza della relazione tra JV su S e la pressione, e l'intercetta sull'asse della pressione è la differenza di pressione oncotica effettiva attraverso la parete del vaso. Se combinata con altre tecniche come la marcatura immunofluorescente e la microscopia confocale, o anche la microscopia elettronica a trasmissione, la microprofusione fornisce una potente analisi dell'endotelio microvascolare e della funzione utilizzando vasi di permeabilità nota. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come effettuare misurazioni ripetute della conducibilità idraulica o della permeabilità all'acqua dei microvasi ulari nella sentinella del ratto in condizioni sperimentali controllate.

È possibile utilizzare questo approccio nei modelli di ratti attualmente disponibili, ma sono particolarmente interessato alla possibilità che possa essere utilizzato in nuovi ratti geneticamente modificati che diventeranno disponibili con la tecnologia CRISPR Cas nine, e spero che venga estesa in questo modo.