Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i percorsi di segnalazione che regolano i cambiamenti nella massa funzionale delle cellule beta. Questo viene ottenuto in isolotti pancreatici di ratto sovraesprimendo o sopprimendo l'espressione di un gene mediante vettori adenovirali. Dopo questa manipolazione, la funzione delle cellule beta viene valutata tramite il rilascio di insulina e la replicazione degli isolotti misurata mediante incorporazione di timidina triziata.

Infine, questi saggi possono mostrare se un gene di interesse regola la proliferazione e/o la funzione delle cellule beta in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule beta, come ad esempio se un particolare componente di un pathway di segnalazione influisce sulla crescita e sulla funzione delle cellule beta. Preparare una piastra da sei pozzetti non rivestita per colture cellulari aggiungendo due millilitri di mezzo modificato al numero richiesto di pozzetti.

Ad esempio, un esperimento tipico può richiedere tre pozzetti, uno ciascuno per un controllo senza virus, un controllo con virus e il gruppo sperimentale; riscaldare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari per almeno 30 minuti. Immediatamente dopo l'isolamento degli occhietti del ratto, posizionare da uno a 200 occhietti in ciascun pozzetto della piastra preparata. 60 occhietti verranno utilizzati per saggi biochimici e gli occhietti rimanenti possono essere utilizzati per studi sull'espressione genica o per immunoblotting; agitare delicatamente la piastra per far convergere gli occhietti al centro di ciascun pozzetto.

Quindi pipettare immediatamente l'adenovirus direttamente sui fori, al centro della piastra. Utilizzare una multiplicità di infezione compresa tra 1 e 500, a seconda dell'efficacia dell'adenovirus nell'overesprimere o ridurre il livello della proteina di interesse.

Una penetrazione adenovirale efficiente nel nucleo della palpebra aumenta la coerenza dei risultati. È essenziale trasdurre le palpebre immediatamente dopo l'isolamento della palpebra.

Non disturbare la piastra per cinque minuti, quindi trasferirla nell'incubatore per 24 ore. Il giorno successivo, rimuovere la piastra dall'incubatore e gonfiare delicatamente i dischetti verso i centri dei pozzetti. Trasferire i dischetti in un nuovo pozzetto contenente mezzo fresco utilizzando una micropipetta da 200 microlitri.

Se gli anellini aderiscono alla piastra, possono essere delicatamente staccati utilizzando la punta della pipetta. È utile utilizzare un virus controllo che esprime GFP per verificare l'efficienza di trasduzione mediante microscopia confocale, al fine di visualizzare la penetrazione dell'adenovirus nella coltura del nucleo degli isolotti. Gli isolotti vengono mantenuti per uno a tre giorni aggiuntivi, cambiando il mezzo ogni giorno.

Il tempo di coltura deve essere ottimizzato mediante studi pilota e varia in base agli obiettivi sperimentali. Per le ultime 24 ore, aggiungere timidina triziata nel mezzo in una concentrazione di un microcurie per millimetro di mezzo. Preparare innanzitutto frescamente 50 millilitri del SAB di lavoro in un tubo conico da 50 millilitri e riscaldarlo in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius.

Introdurre con una pipetta 10 millilitri di SAB attivo in un tubo conico da 15 millilitri e aggiungere 66,8 microlitri di D-glucosio 2,5 M. Per preparare l'SAB ad alto contenuto di glucosio, aggiungere 44,8 microlitri di D-glucosio 2,5 M ai rimanenti 40 millilitri di SAB attivo. Per preparare l'SAB a basso contenuto di glucosio, etichettare successivamente tre tubi da microcentrifuga da 1,7 millilitri.

Per ogni pozzetto della piastra a sei pozzetti, aggiungere un millilitro di PBS in ogni provetta. Non dimenticare di seguire i protocolli istituzionali per la manipolazione e lo smaltimento degli occhioli radioattivi. Utilizzando un stereomicroscopio o un microscopio standard, selezionare e trasferire 20 occhioli di dimensioni comparabili in ciascuna provetta microcentrifuga.

Ad esempio, ogni tubo può contenere cinque occhielli di piccole dimensioni, dieci di medie dimensioni e cinque di grandi dimensioni. Sebbene i risultati vengano normalizzati rispetto al contenuto totale di proteine alla fine dell'esperimento, è fondamentale abbinare le dimensioni degli occhielli tra i diversi gruppi. Dopo aver permesso agli occhielli di depositarsi sul fondo del tubo per gravità o mediante centrifugazione, aspirare, pesare il PBS con una micropipetta e quindi procedere con la preparazione degli occhielli per i saggi biochimici.

Per preparare i pozzetti per il saggio di secrezione dell'insulina, è necessario prima preincubarli con SAB a basso contenuto di glucosio. A tale scopo, aggiungere 400 microlitri di SAB a basso glucosio nei tubi e posizionarli con i tappi nell'incubatore per colture cellulari per 60 minuti. Trascorso un'ora, aspirare il SAB a basso glucosio utilizzato per la preincubazione per misurare la secrezione basale di insulina. Ripetere quindi la procedura di preincubazione.

Tuttavia, per misurare la secrezione stimolata di insulina, utilizzare 400 microlitri di SAB con alta concentrazione di glucosio anziché SAB con bassa concentrazione di glucosio e, come in precedenza, incubare le anellature per 60 minuti. Dopo l'incubazione in SAB con alta o bassa concentrazione di glucosio, aspirare e raccogliere il SAB per il radioimmunodosaggio dell'insulina, che verrà eseguito secondo il protocollo del produttore. Procedere quindi con il saggio di incorporazione della timidina utilizzando lo stesso lotto di anellature, partendo dalle anellature appena utilizzate per il saggio di secrezione dell'insulina.

Aggiungere un millilitro di PBS e lasciare sedimentare gli anelli per gravità. Quindi aspirare il PBS con una micropipetta. Scartare e ripetere questo passaggio un'altra volta.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di acido tricloroacetico ghiacciato nei pozzetti e incubarli sul ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i tubi a quattro gradi Celsius. Quindi aspirare e scartare l'acido TCA.

Successivamente, aggiungere 80 microlitri di idrossido di sodio 0,3 N e incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, vortexare vigorosamente i campioni per cinque-dieci secondi ogni 10 minuti. In parallelo, aggiungere quattro millilitri di un cocktail per conteggio sicuro per alimenti a provette da 7 millilitri destinate al conteggio mediante scintillazione liquida.

Al termine dell'incubazione dei campioni, aggiungere 50 microlitri dei campioni in un tubo da scintillazione. Agitare brevemente il tubo chiuso e misurare l'attività radioattiva dei campioni mediante un contatore a scintillazione liquida. Per misurare anche la concentrazione proteica, trasferire 10 microlitri di vilas in un saggio commerciale di acido bionico e seguire il protocollo del produttore.

In seguito, durante l'analisi dei dati, normalizzare i risultati rispetto alla concentrazione proteica utilizzando i protocolli descritti. Riproduzione degli isolotti e funzione delle cellule beta. Negli isolotti di ratto, è stata valutata un'espressione virale adenovirale del gene ipotetico sei, che ha stimolato in modo robusto la riproduzione degli isolotti senza alterare la funzione delle cellule beta.

Espressione aumentata del gene sei, sintesi del DNA aumentata misurata tramite l'incorporazione di timidina poiché la maggior parte delle cellule nell'occhiello del ratto è costituita da cellule beta. Ulteriori esperimenti potrebbero dimostrare che l'aumento dell'incorporazione di timidina è dovuto a un incremento della replicazione delle cellule beta. Il saggio di secrezione di insulina ha dimostrato che la sovraespressione del gene sei non altera una delle principali funzioni delle cellule beta, ovvero la secrezione di insulina in condizioni di glucosio basso e alto.

L'aumento della secrezione di insulina a basse e alte concentrazioni di glucosio riflette lo stato di salute delle isole pancreatiche dopo il trattamento con adenovirus. Se l'aumento dell'espressione del gene sei compromettesse la funzione delle cellule beta, ciò si manifesterebbe probabilmente con una riduzione dell'insulina secreta a elevate concentrazioni di glucosio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come misurare la replicazione delle cellule beta e la secrezione di insulina per determinare se un particolare gene influisce sulla crescita o sulla funzione delle cellule beta.