Ottimizzazione iterativa di duplex di DNA per cristallizzazione di Seqa-DNA Complessi

Questo esperimento descrive come ottenere cristalli di qualità adatta alla diffrazione per una proteina legata al DNA contenente una ripetizione in tandem di GATC emimetilata. La ripetizione favorisce l'impaccamento cristallino del complesso proteina-DNA. Iniziare con la progettazione razionale della lunghezza del DNA, della distanza tra le sequenze GATC e delle estremità del DNA; procedere quindi con gli oligonucleotidi singoli complementari per purificare il DNA e poi annealare per formare il duplex di DNA emimetilato; infine, aggiungere SeqA purificata per formare il complesso.

Successivamente, determinare le condizioni ottimali per far crescere cristalli di qualità adatta alla diffrazione del complesso proteina-DNA, effettuando prove di cristallizzazione con schermate sparse commerciali. Risultati dimostrativi. Condividere l'effetto della variazione della lunghezza del DNA, dello spaziamento GATC e dei suoi estremi sulla qualità di diffrazione dei cristalli di DNA CQ A.

L'obiettivo di questo lavoro è ottenere cristalli di qualità adatta alla diffrazione di CK legato al DNA, ma può anche contribuire a comprendere le variabili generali da considerare durante la progettazione di duplex di DNA per la cristallizzazione di altri complessi proteina-DNA. La procedura qui descritta sarà utilizzata da Chang, A, dottoranda del mio laboratorio. Questo studio impiega una variante delle proteine regolatrici della replicazione del DNA, Seek a, che forma dimeri stabili e presenta una regione di collegamento abbreviata tra i suoi domini di oligomerizzazione e di legame al DNA.

Questa variante limita il legame al DNA a ripetizioni tandem di GATC separate esclusivamente da un giro completo della doppia elica. Trasformare inizialmente le cellule BBL 20 1D con il plasmide che codifica per DEMETRIC seq A sotto il controllo del promotore T7. Piastrare la reazione di trasformazione su piastre di agar LB contenenti 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e incubare in incubatrice batterica per tutta la notte. Scegliere colonie miste e avviare una coltura notturna su piccola scala.

Il mattino seguente, inoculare un litro di coltura con 10 millilitri dell'inoculo preparato durante la notte. Quando la coltura è in fase logaritmica, aggiungere due millilitri di IPTG 0,5 molarità per indurre la produzione della proteina. Proseguire l'incubazione per tre ore in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius.

Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.300 ×g per 10 minuti. Reese, sospendere il pellet cellulare nel buffer di purificazione, sottoporre a sonicazione e chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 39.000 ×g per 40 minuti. A questo punto, caricare il supernatante S su una colonna a eparina equilibrata con il buffer di purificazione.

Per eluire la proteina CK, utilizzare un gradiente lineare fino a un cloruro di sodio 1 M; la proteina CK viene eluita a circa 0,7 M di cloruro di sodio. Raccogliere le frazioni contenenti CK e diluirle per ridurre la forza ionica del campione.

Quindi caricare il campione su una colonna di cromatografia a scambio cationico E equilibrata con tampone di purificazione. Applicare un gradiente lineare di sale per eluire la proteina CK pura a circa 0,4 moli di cloruro di sodio. Combinare le frazioni contenenti CK.

Concentrare a tre milligrammi per millilitro e conservare in condizioni di stoccaggio. Progettare un buffer con oligonucleotidi unmethylati e methylati complementari. Preparare campioni di un micromole di ciascun filamento singolo di DNA liofilizzato in 800 microlitri di acqua distillata e autoclavata, vortexare e lasciare in posa per 15 minuti ora e 800 microlitri.

Aggiungere a ogni campione due volte il buffer di caricamento e preparare un grande gel denaturante al 10% per oligonucleotidi lunghi da 20 a 30 nucleotidi. Una volta polimerizzato, rimuovere il pettine e risciacquare accuratamente i pozzetti. Assemblare il gel riempiendo i serbatoi superiore e inferiore con buffer di corsa TBE una volta.

Eseguire una pre-correzione del gel a 750 volt per riscaldare il gel fino a 55 gradi Celsius. Quindi arrestare la corsa e risciacquare accuratamente i pozzetti con tampone di corsa. Ora riscaldare gli oligonucleotidi a 90 gradi Celsius per due minuti.

Vortex e centrifuga. Procedere immediatamente al caricamento dei campioni sul gel. Eseguire l'elettroforesi a circa 700 volt finché l'oligonucleotide non ha migrato.

A metà corsa su un gel di poliacrilammide al 10%, il blu fenolo alfa co-migra con oligonucleotidi di circa 20 basi di lunghezza e il blu xilenolo SS con circa 60 basi di lunghezza. Smontare il gel dall'apparato e rimuovere le distanziali su una superficie piana. Rimuovere una lastra di vetro e coprire il gel con pellicola trasparente.

Quindi capovolgere il gel, rimuovere l'altra lastra di vetro e coprire il gel con della pellicola trasparente. Successivamente, marcare le bande utilizzando la luce UV e una piastra fluorescente posta dietro il gel. Per vedere l'ombra del DNA con una lametta, escindere la banda e tagliarla in piccoli pezzi.

Trasferire ogni campione in una provetta sterile da 15 millilitri. Aggiungere nove millilitri di tampone eluente e diluire durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Trasferire attentamente la soluzione in una provetta per centrifuga autoclavabile utilizzando una punta per pipetta per caricamento di gel.

Per evitare il trasferimento di frammenti di acrilamide, aggiungere un millilitro di acetato di sodio 3 mM a pH 7 più 25 millilitri di etanolo al 100% freddo e incubare a meno 20 gradi Celsius per almeno tre ore. Centrifugare il DNA precipitato. Quindi asciugare i pellet nel speed vac a temperatura media, risospendere ciascun pellet in 400 microlitri di acqua doppio-distillata e autoclavata e trasferire in una provetta nuova.

Aggiungere 40 microlitri di acetato di sodio tre molare a pH sette e un millilitro di etanolo al 100%, vortexare e incubare per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius dopo centrifugazione per 15 minuti a 18.000 volte. G, risciacquare i pellet di DNA con 100 microlitri di etanolo freddo al 70% per rimuovere eventuali sali residui, centrifugare per sei minuti a 18.000 volte. G, quindi scartare l'etanolo e asciugare il pellet su un evaporatore sotto vuoto.

Ora risospendere ogni pellet in 100 microlitri di acqua doppio-distillata autoclavata. Determinare la concentrazione degli oligonucleotidi mediante spettrometria. Per preparare i duplex di DNA emimetilati, mescolare innanzitutto concentrazioni molari equimolari dei filamenti singoli complementari.

Quindi riscaldare le miscele a 95 gradi Celsius in un bagno d'acqua per cinque minuti per denaturare i filamenti. Lasciare raffreddare lentamente i campioni fino alla temperatura ambiente all'interno del bagno d'acqua. Combinare volumi uguali di proteina CQ purificata a 81 micromolare e DNA emimetilato a 81 micromolare.

Quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Effettuare lo screening delle condizioni di cristallizzazione utilizzando schermi commerciali a matrice sparca. Una volta identificate le condizioni iniziali di cristallizzazione, ottimizzarle per ottenere cristalli di qualità adatta alla diffrazione. Crioproteggere i cristalli di DNA di CK risultanti.

Aumentare la quantità di PEG 400 presente nella soluzione di cristallizzazione fino a una concentrazione finale del 25% oppure aggiungere il 20% di glicerolo alla soluzione di cristallizzazione. Prelevare i singoli cristalli con un loop di nylon mediante congelamento rapido. Congelare i campioni in azoto liquido.

Ora testare il limite di diffrazione di ogni cristallo a 100 K. Per ottenere la struttura cristallina della variante troncata di CK legata al DNA emimetilato, ottimizziamo consecutivamente tre parametri sul DNA: la distanza tra le sequenze GATC emimetilate, la lunghezza del duplex e l'assenza o la presenza di estremità sporgenti al capo 5'. Questo studio utilizza una variante DME di seek a con una mutazione puntiforme nel dominio terminale che impedisce ulteriori processi di ligamentazione e un linker abbreviato che limita il legame al DNA in tandem.

Ripetizioni GATC separate esclusivamente da un giro completo del DNA nei saggi di spostamento della mobilità elettroforetica indicano che la proteina CK modificata si lega preferenzialmente a ripetizioni GATC separate da nove a dieci paia di basi. Pertanto, gli schermi iniziali utilizzano duplex lunghi da 23 a 24 paia di basi contenenti due ripetizioni GATC emimetilate separate da nove o dieci paia di basi.

Tre duplex hanno prodotto cristalli ben formati. Sebbene nessuno dei cristalli abbia diffratto a elevata risoluzione, i dati hanno indicato che una separazione di nove paia di basi tra le sequenze A-G-A-T-C era preferita per la cristallizzazione; l'inserimento di un dinucleotide CG tra i due siti GATC potenzia inaspettatamente le interazioni con il solco e con l'impalcatura, senza alterare il limite di diffrazione dei cristalli.

Al contrario, l'ottimizzazione della lunghezza degli sbalzi ha modificato in modo significativo i contatti molecolari e la morfologia del cristallo. La struttura cristallina di questa proteina CK legata a un duplex di DNA emimetilato ha confermato che la faccia libera del duplex di DNA non partecipa ai contatti cristallini nonostante le dimensioni relative tra proteina e DNA; la maggior parte delle interazioni tra molecole simmetriche è mediata da proteina-proteina e da interazioni tra proteina e DNA. Curiosamente, in questo caso specifico, l'effetto benefico di uno sbalzo dinucleotidico in posizione cinque prime non è dovuto alla formazione di un DNA pseudo continuo.

Invece, l'estremità 5' del filamento metilato si proietta lontano dall'asse del DNA e interagisce con la molecola di CK prossimale del complesso, spiegando perché erano strettamente necessari due nucleotidi per modificare il reticolo cristallino. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare le proteine e progettare duplex di DNA per la cristallizzazione di complessi proteina-DNA. È importante ricordare che, sebbene questo protocollo sia stato concepito per cristallizzare il complesso proteina chinasi-DNA, l'ottimizzazione razionale della lunghezza, della sequenza e delle estremità del DNA fornisce un quadro generale per la progettazione di duplex di DNA finalizzata alla cristallizzazione di altri complessi proteina-DNA.