Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare e identificare batteri mediante sensori elettrochimici. Questo viene ottenuto innanzitutto rilasciando l'RNA ribosomiale dai batteri, consentendo l'ibridazione con la sonda fluorurata di rilevamento; come secondo passaggio, l'RNA ribosomiale legato alla sonda di rilevamento viene aggiunto all'elettrodo di lavoro, permettendo l'ibridazione con la sonda di cattura sulla superficie del sensore. Successivamente, si permette al coniugato di anti-fluoresceina perossidasi da ravanello affoglio di legarsi alla sonda di rilevamento fluorurata.

Infine, nella corrente interferometrica, l'intensità, che è correlata al numero di complessi tra sonde di cattura ribosomiali e sonde rivelatrici di RNA sulla superficie del sensore, può essere ottenuta. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi basati sulla coltura è che i batteri possono essere rilevati e identificati in circa 45 minuti, evitando l'attesa notturna necessaria affinché un batterio formi una colonia visibile su una piastra EDGAR. L'applicazione di questa tecnica migliorerebbe la gestione delle malattie infettive.

La rilevazione precoce dei patogeni batterici è essenziale per una terapia antibiotica mirata e per il miglioramento degli esiti clinici. Sebbene questo metodo sia utile per la diagnosi di malattie infettive, può essere applicato anche ad altri problemi diagnostici, come l'immunodiagnosi. Iniziare incubando la sonda di cattura diluita con esa-1,6-dioltio per 10 minuti a temperatura ambiente, al fine di ridurre il gruppo tiolo presente sulla sonda di cattura, ottenendo così risultati più consistenti.

Dopo l'incubazione, applicare un flusso di azoto su 16 chip dell'array sensoriale in oro per cinque secondi per rimuovere qualsiasi traccia di umidità o particelle. Volumi ridotti di liquido devono essere applicati con attenzione sull'elettrodo di lavoro nell'array sensoriale. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale.

Un'esecuzione corretta delle tecniche di pipettaggio, lavaggio e asciugatura riduce notevolmente la variabilità tra chip. Successivamente, applicare sei microlitri della miscela diluita del sonda di cattura HDT sull'elettrodo di lavoro di tutti e 16 i sensori dell'array e conservare i chip sensibili in una capsula di Petri coperta a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, lavare i chip sensori con acqua deionizzata per due o tre secondi, quindi asciugarli sotto un flusso di azoto per cinque secondi. Applicare ora sei microlitri di soluzione di cloridrato di attri, cloruro di sodio, EDTA e mercaptoetanolo sull'elettrodo di lavoro di tutti e 16 i sensori e incubare i sensori per 50 minuti in una capsula di Petri a temperatura ambiente.

Per preparare i campioni per il saggio con sensore elettrochimico, trasferire un millilitro di coltura batterica in fase logaritmica di crescita in una provetta da microcentrifuga, quindi centrifugare le cellule per cinque minuti a 16.000 ×g. Si noti che i batteri patogeni devono essere manipolati all'interno di una cappa a sicurezza biologica.

Dopo aver rimosso lo snat, applicare alla base del tubo microcentrifuga una punta di pipetta contenente 10 microlitri di idrossido di sodio uno molare ed eseguire alcune aspirazioni e dispersioni per risospendere completamente il pellet. Dopo aver incubato la sospensione a temperatura ambiente per cinque minuti, aggiungere 50 microlitri di PBS contenente albumina sierica bovina o BSA e una sonda fluoroesceina modificata per rivelatori per neutralizzare il lisato batterico. Quindi, incubare il lisato neutralizzato per 10 minuti a temperatura ambiente.

Iniziare questo passaggio lavando la soluzione di mercaptoetanolo da uno dei chip sensori preparati con acqua deionizzata per due o tre secondi. Dopo aver asciugato il chip come appena dimostrato, applicare quattro microlitri del lisato batterico neutralizzato sugli elettrodi di lavoro. 14 dei sensori.

Quindi applicare quattro microlitri dell'oligonucleotide di collegamento in PBS più BSA più sonda rivelatrice modificata con fluoresceina ai due sensori di controllo positivo. Dopo aver incubato il lisato e i sensori di controllo positivo per 15 minuti, lavare quindi asciugare l'intero chip sensore come in precedenza. Ora applicare quattro microlitri di anti-fluoresceina con perossidasi di rafano (HRP) in PBS contenente caseina agli elettrodi di lavoro di tutti e 16 i sensori.

Dopo un'incubazione di 15 minuti, lavare e asciugare il chip del sensore. Successivamente, applicare un adesivo per pozzetti sulla superficie del chip del sensore e caricare nel supporto del chip del sensore 50 microlitri di substrato TMB su tutti e 16 i sensori e chiudere il supporto del chip del sensore. Infine, utilizzare un lettore di chip Helios per ottenere misurazioni di pirometria e telemetria ciclica per tutti e 16 i sensori.

Il saggio elettrochimico appena descritto è strutturato in modo simile a un saggio a sandwich tipo ELISA, come mostrato in questa figura: l'ibridazione dell'RNA ribosomiale bersaglio con le sonde di cattura e di rilevamento viene rivelata mediante una reazione redox catalizzata dalla HRP coniugata a frammenti di anticorpi anti-fluoresceina che si legano al legame trifluoresceina presente sulla sonda di rilevamento. Un componente importante della sensibilità del saggio è la chimica superficiale dell'elettrodo d'oro. L'elettrodo d'oro è rivestito con mercaptoetanolo e hinolo ed è funzionalizzato mediante l'aggiunta di sonde di cattura diluite.

L'ibridazione sandwich dell'RNA ribosomiale bersaglio con la sonda di cattura e la sonda rivelatrice marcata con fluoresceina produce un complesso che viene rilevato mediante l'aggiunta del coniugato tra anti-fluoresceina e perossidasi di ravanello, nonché del substrato TMB. La corrente parametrica M è generata dal ciclo redox risultante dall'ossidazione del TMB da parte della perossidasi di ravanello e dalla riduzione del TMB da parte degli elettroni provenienti dall'elettrodo. I saggi qui descritti utilizzano un chip con matrice di sensori gene fluidico da 16 elementi.

Ogni sensore nell'array contiene tre elettrodi, quello di lavoro, quello di riferimento e quello ausiliario, che presentano punti di contatto sul bordo del chip. Il lettore del chip è dotato di pogo pin che si collegano a ciascuno di questi punti di contatto. Il lettore del chip funge da interfaccia tra l'array di sensori e un potenziometro controllato da un algoritmo informatico.

Qui vengono mostrati esempi di flusso di corrente in un sensore elettrochimico. Il flusso di corrente nei sensori è artificialmente elevato durante i primi secondi successivi all'inizio delle misurazioni parametriche. A causa dell'accumulo del substrato ossidato nel periodo compreso tra l'applicazione del TMB sulla superficie del sensore e l'avvio dell'algoritmo del lettore, il flusso di corrente raggiunge rapidamente uno stato stazionario e letture affidabili del sensore possono essere ottenute in modo sicuro entro 60 secondi.

La variabilità tra sensore e sensore è relativamente costante, quindi è possibile eseguire in parallelo 16 diversi saggi su un chip con matrice di 16 sensori a fluidica genica. I controlli positivi e negativi sono essenziali: come controllo positivo viene utilizzato un oligonucleotide di DNA di collegamento sintetico che ibridizza sia con le sonde di cattura che con quelle di rilevamento, fungendo da bersaglio sintetico di concentrazione nota. I risultati ottenuti utilizzando l'oligonucleotide di collegamento funzionano da controllo interno di calibrazione per ridurre al minimo le variazioni tra chip diversi.

Più elevata è la corrente negativa dell'elettrodo, maggiore sarà il segnale. Durante il test di sonde di cattura e di rilevamento. Il limite di rilevazione deve essere determinato mediante diluizione seriale di un campione di concentrazione nota, come mostrato in questa figura; esiste una correlazione lineare log-log tra la concentrazione del campione e l'output del segnale nell'intervallo dinamico del saggio.

In questi istogrammi, sono mostrati i risultati rappresentativi per campioni contenenti Escherichia coli e Klebsiella, nonché ammoniaca, sostanze spesso riscontrate nell'urina di pazienti con infezione delle vie urinarie. I segnali per la maggior parte dei sensori saranno bassi e simili, e questi risultati negativi possono essere raggruppati come segnale di fondo. La coppia di sonde KE distingue Klebsiella da E. coli. L'oligonucleotide di collegamento funge da controllo positivo e standard di calibrazione interno. Questa tecnica può essere applicata alla rilevazione di batteri resistenti agli antibiotici in campioni clinici misurando la risposta fenotipica dei batteri agli antibiotici.

Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la terapia ottimale per un singolo paziente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare e identificare i batteri confrontando le correnti atriali nei diversi sensori specifici per specie presenti nel chip.