Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare simbionti batterici marcati con fluorescenza all'interno del loro ospite nematode. Questo viene ottenuto innanzitutto etichettando i batteri con una proteina fluorescente mediante coniugazione. Il secondo passaggio consiste nell'isolare i nematodi AIC raccogliendo le uova.

Successivamente, i nematodi AIC vengono coltivati in associazione con il loro simbionte batterico marcato con fluorescenza, in modo da permettere l'associazione naturale e, in ultima analisi, la localizzazione del simbionte batterico all'interno dell'ospite nematode. La frequenza di questa associazione all'interno della popolazione di nematodi può essere determinata mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della simbiosi, come ad esempio dove i batteri si localizzano all'interno del loro ospite e quale sia la distribuzione del trasporto batterico all'interno di una popolazione di ospiti?

Dopo la crescita notturna dei ceppi batterici, effettuare un'immersione di trapianto dei ceppi donatori, riceventi e ausiliari in un mezzo di coltura ricco di nutrienti, privo di antibiotici, in un rapporto di uno a 100 tra coltura e mezzo, quindi coltivare le colture alla temperatura appropriata per ciascun ceppo fino al raggiungimento della fase di crescita logaritmica media. Successivamente, unire i ceppi in un'unica provetta da microcentrifuga e centrifugare le colture miste per due minuti a 17.900 ×g, decantare il soprannatante e sospendere il pellet in 30 microlitri di mezzo fresco. Quindi, depositare la sospensione su una piastra di mezzo ricco di nutrienti priva di antibiotici e lasciare asciugare la goccia una volta che la sospensione si è asciugata.

Incubare la piastra capovolta durante la notte a una temperatura ottimale per il batterio ricevente e compatibile con il donatore e l'helper, se applicabile. A questo punto, raschiare la colonia e fare una semina per ottenere colonie isolate su una piastra contenente antibiotico selettivo, al fine di ottenere una coltura pura di batteri, rappresentata da una singola colonia per l'isolamento. Infine, verificare che le colonie risultanti siano il simbionte ricevente e non il ceppo donatore.

Analizzando la presenza di fenotipi specifici del ricevente. Ad esempio, i batteri cino abdi possono essere distinti dagli e coli eseguendo un test catalitico, valutando la presenza del plasmide mediante conferma della fluorescenza alla lunghezza d'onda corrispondente alla proteina fluorescente del plasmide. Dopo aver coltivato il simbionte batterico naturale per tutta la notte, distribuire 600 microlitri della coltura batterica su otto-dieci piastre da 10 millimetri contenenti agar lipidico, quindi incubare le piastre al buio e in assenza di umidità a 25 gradi Celsius.

Dopo due giorni, aggiungere 5.000 nematodi giovanili infettivi in 500 microlitri di mezzo alle colonie batteriche. Dopo aver incubato le piastre a 25 gradi Celsius per altri tre giorni, posizionare 20 microlitri di acqua su un vetrino da microscopio. Successivamente, utilizzare un bastoncino sterile per prelevare una piccola quantità di nematodi dalla colonia batterica.

Inserire il bastoncino nell'acqua per consentire ai nematodi di nuotare via. Osservare questo vetrino a bassa ingrandimento. Se sono visibili uova e femmine, continuare quando le femmine contengono uova; aggiungere alcuni millilitri di acqua sulla superficie delle piastre, agitare delicatamente le piastre e quindi versare l'acqua in un tubo conico da 50 millilitri.

I nematodi dovrebbero staccarsi dalle piastre e non essere più visibili sulla superficie della piastra. Lasciare sedimentare i nematodi sul fondo del tubo, quindi aspirare l'acqua in eccesso dalla parte superiore del tubo e riempire nuovamente il tubo con acqua pulita. Dopo aver lasciato sedimentare i nematodi adulti e aver rimosso nuovamente l'acqua in eccesso per aspirazione, riempire i tubi conici con la soluzione per uova.

Quindi mescolare i tubi mediante inversione delicata per esattamente 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver agitato, centrifugare immediatamente i tubi conici per esattamente 10 minuti a 1.250 G e a temperatura ambiente con il freno attivato. Quindi decantare rapidamente il sopranatante, risospendere il pellet con la soluzione di uova mediante pipettaggio e riempire il tubo conico con soluzione di uova fresca.

Mescolare bene la sospensione di uova capovolgendo il tubo da tre a cinque volte, quindi centrifugare immediatamente le uova e decantare il sopranatante come appena mostrato. Risospendere il pellet in misogino, brodo o LB mediante pipettaggio, quindi trasferire la sospensione di uova in un tubo conico da 15 millilitri. Riempire ora il tubo da 15 millilitri con LB, lavare le uova tre volte nel brodo utilizzando la stessa tecnica rapida appena dimostrata, quindi diluire le uova di P. nematode risospese a un minimo di 10 uova per microlitro.

Trasferire le uova in una piastra di Petri da sei centimetri contenente cinque millilitri di LB e antibiotici contro i batteri colonizzatori. La piastra può essere conservata avvolta in perfil per un massimo di quattro giorni dopo la crescita notturna e la selezione dei batteri fluorescenti. Utilizzare un bastoncino sterile per distribuire 600 microlitri della coltura batterica su aerati lipidici da 10 millimetri e per incubare la coltura a 25 gradi Celsius.

Dopo due giorni, distribuire da 500 a 5.000 uova di nematodi su ciascuna piastra lipidica. Se la piastra è stata conservata, lavare le uova in 15 millilitri di LB come appena illustrato, almeno una volta prima di inoculare le uova sui prati batterici preparati in precedenza. Successivamente, incubare le colture co-colturali di nematodi e batteri al buio e in assenza di umidità a 25 gradi Celsius fino a quando non compaiono gli stadi giovanili infettivi, riconoscibili come un anello bianco sfocato sul bordo della piastra.

Quando si sono osservati gli stadi giovanili infettivi, rimuovere il coperchio della piastra di agar lipidico e posizionare il fondo della piastra all'interno del fondo di una capsula di Petri vuota da 100 millimetri per 20 millimetri. Successivamente, riempire la capsula di Petri con acqua sufficiente a raggiungere circa metà dell'altezza della piastra più piccola e incubare la trappola ad acqua fino a quando gli stadi giovanili infettivi progeni non saranno emersi nell'acqua.

Dopo aver raccolto i nematodi dall'acqua o dallo stadio di sviluppo desiderato dal relativo prato batterico, sciogliere alcuni granelli di ole in 30 microlitri di acqua e aggiungere da uno a due microlitri di questo agente paralizzante per ogni 50 microlitri di campione di nematodi. Successivamente, trasferire circa 20-30 microlitri del campione di nematodi paralizzati su un vetrino da microscopio e posizionare un coprivetrino sopra il campione. Osservare i nematodi mediante microscopia ottica per assicurarsi che siano presenti nel campo visivo.

Per identificare la localizzazione batterica. Fotografare i nematodi mediante microscopia fluorescente oltre che con l'impostazione di microscopia ottica, quindi sovrapporre le immagini. Potrebbe essere necessario provare diverse ingrandimenti e viste del nematode per individuare i batteri.

È stata conteggiata e valutata una popolazione di nematodi provenienti da due diversi mezzi per la colonizzazione da parte del simbionte batterico. Per ottenere statistiche robuste, è consigliabile contare almeno 100 nematodi per campione, con almeno 30 appartenenti a ciascuna categoria come mostrato nella tabella. Questi nematodi risultano colonizzati a un livello di circa il 14,6% quando cresciuti su agar lipidico e del 68,6% quando cresciuti su agar di fegato e rene.

È stato dimostrato che altre specie di nematodi e batteri presentano livelli diversi di colonizzazione. Questo schema illustra l'aspetto generale delle femmine di Steiner NEMA. L'immagine ingrandita mostra l'immagine in contrasto di interferenza differenziale di una femmina S fot grafica a un ingrandimento di 20 x.

La freccia nera nell'insetto indica la vulva, mentre le frecce bianche indicano le uova visibili. Questa immagine mostra un uovo sviluppato ma non schiuso di nematode volt a un ingrandimento di 40 x, e queste uova isolate da nematodi Volta sono state acquisite a un ingrandimento di 10 x. Qui, immagini rappresentative al microscopio di nematodi Steiner Nima associati a batteri Xeno aptus sono mostrate in questa prima immagine.

I nematodi di Alvin erano associati al loro simbionte batterico expo che esprimeva GFP, per creare questa immagine composita. Un'immagine a contrasto di fase è stata sovrapposta a un'immagine fluorescente. La freccia indica i batteri presenti all'interno del nematode giovanile infettivo.

Questa immagine mostra un nematode giovanile di S carpa capsi con X nla che esprime GFP. L'immagine è stata ottenuta in maniera analoga all'immagine precedente e rappresenta il nematode giovanile con batteri marcati mediante proteina verde fluorescente, visibili come bacilli verdi localizzati lungo il lume intestinale del nematode. Oltre alla procedura descritta, altri metodi, come la manipolazione genetica del simbionte batterico prima dell'associazione con l'ospite nematode, possono essere integrati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali sono i meccanismi molecolari necessari per l'associazione tra ospite e microbo.