Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode

Questo video illustra una procedura per identificare i geni che regolano la crescita di *C. elegans* e le dimensioni corporee. Utilizzando l'interferenza dell'RNA o RNAi per inattivare geni candidati, si preparano prima piastre contenenti batteri che esprimono RNA a doppio filamento, mirati ai geni di interesse. Larve di quarta fase vengono trasferite su piastre RNAi.

Una volta raggiunta la fase di giovane adulto, vengono trasferiti su nuove piastre RNAi per la deposizione delle uova. Dopo diverse ore, vengono rimossi, lasciando popolazioni sincronizzate di embrioni. Allo stadio di sviluppo desiderato, la prole viene raccolta e montata su vetrini.

Infine, vengono acquisite immagini al microscopio dei vermi. L'analisi dell'immagine mostra modifiche nelle dimensioni corporee causate dall'inattivazione genica. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per identificare regolatori della via di segnalazione TGF beta, può anche essere applicato ad altre vie che regolano lo sviluppo post-embrionale in *C. elegans*, come la via di segnalazione dell'insulina.

Iniziare questa procedura clonando le sequenze del gene bersaglio nel vettore L 4 4 4 0 A, un plasmide comunemente utilizzato per l'RNAi in vermi; trasformare il plasmide ricombinante nella ceppa batterica HT one 15 DE three. Coltivare i batteri trasformati su piastre di agar LB contenenti 25 microgrammi per millilitro di carbenicillina e 12,5 microgrammi per millilitro di tetraciclina, quindi selezionare una singola colonia per l'uso futuro.

Nel frattempo, trasformare il vettore vuoto L 4 4 4 0 nella ceppa batterica HT one 15. Utilizzare come controllo per la coltura sperimentale i batteri trasformati in un millilitro di brodo LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina, incubati tutta la notte a 37 gradi Celsius.

La tetraciclina non viene aggiunta perché riduce l'efficienza dell'RNAI. Aggiungere altri cinque millilitri di brodo LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina alla coltura notturna, quindi incubare per altre quattro-sei ore a 37 gradi Celsius. Una volta che la coltura è pronta, seminare 0,5 millilitri di batteri sperimentali o di controllo sulle piastre di vermi RNAI etichettate con il nome del clone appropriato.

Per ogni condizione devono essere preparate almeno due piastre. Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo.

Deve essere presente un tappeto batterico che esprime RNAi con o senza la sequenza del gene bersaglio. Gli animali utilizzeranno i batteri come fonte alimentare. Una volta pronti i piatti per l'alimentazione con RNAi, sterilizzare la punta di un filo di platino alla fiamma.

Quindi utilizzare il filo di platino per trasferire da sei a dieci larve di quarto stadio o stadio L4 di C. elegans ermafroditi su ciascuna piastra RNAi. Lasciare crescere gli ermafroditi a 20 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, gli animali saranno giovani adulti.

Trasferirli in una nuova piastra RNAi opportunamente etichettata e preparata. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per quattro-sei ore per consentire agli adulti di deporre le uova. Al termine dell'incubazione, rimuovere tutti gli adulti dalla piastra per sincronizzare la prole.

Una volta rimossi gli adulti, iniziare a contare il tempo. Questo è il tempo zero. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per permettere agli animali di svilupparsi fino allo stadio di interesse.

Qui verranno selezionati giovani adulti per l'analisi fenotipica. Per gli abbattimenti genici che si sviluppano a un ritmo normale, è richiesta un'incubazione di 72 ore. Tieni presente che diversi geni influenzano lo sviluppo dell'animale in modo differente, quindi i tempi di incubazione potrebbero necessitare di essere aggiustati.

Se l'RNAi causa un tasso di crescita diverso negli animali, gli adulti giovani possono essere identificati come quelli non oltre 24 ore dopo lo stadio L4 con sviluppo VUL completato e da due a sei embrioni nell'utero, come mostrato qui. Per identificare altri stadi di sviluppo, lo sperimentatore deve utilizzare lo sviluppo gonadico e VUL come riferimento. Una volta che gli animali sono cresciuti fino allo stadio appropriato, prepararsi a valutare i fenotipi della dimensione corporea nei vermi trattati con RNAi.

Successivamente, posizionare due strati di nastro adesivo colorato su un vetrino in vetro dello spessore di un millimetro, come mostrato qui. Preparare due di questi vetrini. Quindi inserire un nuovo vetrino tra i due vetrini con il nastro e applicare una goccia di Agros al 2% fuso in acqua.

Al centro del nuovo vetrino, premere un secondo vetrino sopra per creare un tampone di agar sottile. Una volta che l'agar si è solidificato, rimuovere il vetrino superiore. Il vetrino con il tampone di agar è pronto per essere caricato con i vermi.

Etichettare il vetrino con il nome del clone. Aggiungere 10 microlitri di azide di sodio 25 millimolare al tampone aros. Quindi, utilizzando un filo di platino come in precedenza, trasferire da 30 a 40 animali nella soluzione di azide di sodio.

Per immobilizzarli, posizionare un coprivetrino sulla parte superiore. Eseguire questa operazione sia per gli animali ricombinanti che per quelli privi di L 4 4 4 0 trasfettati con RNAi. Successivamente, posizionare il vetrino graduato sotto il microscopio stereoscopico con un obiettivo da 2,5 x.

Utilizzando Q Capture o un software simile, acquisire un'immagine del righello micrometrico e salvarla. Successivamente, posizionare i vermi sotto la lente e acquisire le immagini. Per misurare innanzitutto la lunghezza del corpo, aprire l'immagine del righello micrometrico nel software Image Pro.

Quindi fare clic su "measure" e scegliere "calibration". Successivamente, selezionare la procedura guidata di calibrazione spaziale con l'opzione "calibrate the active image" attivata. Fare clic su "next".

Inserire il nome per la calibrazione e assicurarsi che le unità di riferimento spaziale siano impostate su micron. Quindi selezionare la casella Crea una calibrazione di riferimento e fare clic su Avanti. Fare clic su disegna linea di riferimento.

Apparirà una barra di scala di riferimento. Riposizionare la barra di scala in modo che corrisponda alle estremità del micrometro. Quindi indicare che il riferimento corrisponde a 1000 unità.

Fare clic su OK. Avanti e fine. Una volta calibrato il software, aprire un'immagine di un verme.

Quindi, nel menu misura, selezionare calibrazione e successivamente fare clic su seleziona spaziale. Nel menu a discesa, selezionare il nome del file creato per la calibrazione del micrometro. Quindi, nel menu misura, selezionare misurazioni nella finestra che si apre.

Selezionare lo strumento di disegno libero e, utilizzando il mouse del computer, tracciare una linea attraverso il centro del corpo dell'animale dalla testa alla coda. La lunghezza verrà riportata nella finestra. Ripetere questo procedimento per tutti gli animali nel campo visivo.

Esportare le misurazioni della lunghezza in un file di Microsoft Excel o in un altro software statistico appropriato. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ogni campione. Successivamente, confrontare i risultati per ciascun gruppo utilizzando un test T di Student.

La proteina DBL uno della superfamiglia del fattore di crescita trasformante beta o TGF beta è necessaria per l'attivazione della via del TGF beta. In risposta all'attivazione del segnale, i trasduttori del segnale intracellulari di tipo smad si traslocano nel nucleo e avviano la trascrizione genica. I vermi eleganti in cui la via del TGF beta è interrotta presentano una taglia corporea ridotta, con una lunghezza del corpo più corta rispetto agli animali di tipo selvatico.

Pertanto, schermate per Caenorhabditis elegans. Mutanti per la dimensione del corpo sono in grado di identificare componenti e modificatori della via di segnalazione TGF beta e di verificare l'efficacia dell'RNAi mediante alimentazione per l'identificazione di mutanti per la dimensione del corpo. L'RNAi è stato utilizzato per ridurre l'espressione dei componenti della via DBL-1, SMA-3 e SMA-6, in quattro ceppi diversi di Caenorhabditis elegans.

I ceppi di C. elegans testati includevano due ceppi ipersensibili all'RNAi, A uno, Lin 15 B e RF tre, oltre al ceppo selvatico standard N due e al ceppo LIN 36, la cui sensibilità all'RNAi è simile a quella di N due, come mostrato qui. Quando l'espressione di SMA tre o SMA sei è stata interrotta, gli animali hanno mostrato una dimensione corporea significativamente più ridotta rispetto agli animali di controllo, ad eccezione dell'RNAi per SMA sei in Lin 36. Sfondo in RF tre.

Le lunghezze del corpo degli adulti giovani dopo il trattamento con RNAi erano dall'84 al 95% rispetto al vettore controllo. In un ceppo Lin-15B, le lunghezze del corpo degli adulti giovani dopo l'RNAi erano dal 68 all'86% rispetto agli animali di controllo. Tuttavia, il ceppo lin-15B produce pochi prole.

Questo li rende inadatti per schermate su larga scala. Pertanto, si consiglia l'uso del ceppo RF a tre ceppi per queste tecniche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i geni che regolano la crescita e le dimensioni corporee utilizzando la tecnica di interferenza RNI.